中药抗牛病毒性腹泻病毒作用研究现状

王 慧 ，杜 锐，周红潮，时 坤，李建明，曾范利，宗 颖*

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林长春 130118；3.吉林省梅花鹿生产与产品应用研究室，吉林长春 130118)

牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，为具有包膜的单股正链RNA病毒[1]。1980年，李佑民在国内首次分离鉴定该病毒[2]。随后，根据BVDV基因组的差异，将BVDV分为1型和2型，根据BVDV在靶细胞中是否引起细胞病变，BVDV又可分为致细胞病变型(cytopathic biotype，CP)和非细胞致变型(non-cytopathic biotype，NCP)[3]。该病毒能够引起多种疾病的发生，如BVDV感染牛群发生牛病毒性腹泻-黏膜病及免疫持续性感染严重疾病，发病率和病死率很高[4]，该病毒引起的疾病已经由世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的传染病。目前统计出牛群每年仅死于牛病毒性腹泻黏膜病的数量不少于500万头[2]。对于BVDV在牛群中出现的流行性感染，世界各地采取的处置方法多是接种疫苗、淘汰净化和做好相应的安全管理[5]。然而，疫苗的使用具有一定的局限性，至今也尚未研制出有效的疫苗来预防BVD[6]，导致BVD预防形势极不乐观。此外，该病毒宿主群正在不断扩大，广泛涉及到鹿、猪、羊及其他野生动物[7]。近年来，BVDV感染人群亦有相关报道。这种情形不仅给养殖业带来了巨大的经济损失[8]，也对人类是一种潜在的威胁。因此，寻找和开发新的安全、高效、低毒的BVDV杀灭抑制剂已势在必行。中药作为我国优势特色资源，因其活性强且不会产生耐药性的特点，已日益成为治疗病毒性疾病药物研究开发的热点[9-11]。现就中药及其复方在抗BVDV中的研究做以归纳和总结，以期为抗BVDV的药物研究开发提供参考。

1 BVDV侵染细胞过程

BVDV感染需要依赖网络蛋白介导的胞吞途径[12]，其生存需要依赖于宿主细胞。如BVDV可在胎牛肾脏细胞(MDBK)、睾丸细胞等多种细胞中进行生存培养。BVDV与细胞表面的特殊受体相结合为起始，经过多级过程入侵和黏附细胞，进入细胞后病毒完成生命周期的复制和翻译[13]。然而，BVDV致病的关键是病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用，它们之间的相互作用不仅可以使病毒进入细胞，而且可以改变宿主蛋白的正常生物学功能，从而导致细胞损伤和持续性感染[14]。从感染动物的角度看，BVDV最初进入上皮细胞、淋巴细胞和单核细胞，在这些细胞中，BVDV将完成复制和扩散在整个淋巴系统，从而感染动物的免疫系统[15]。

2 中药抗病毒作用机理

随着中药的广泛使用，中药的科学价值越来越得到国际的认可[16]，尤其在抗生素滥用导致很多人畜共患病出现的情况下，其在抗病毒方面的显著作用引起了国内外学者们的高度重视。现有关于中药抗病毒的机理和途径相关研究结果表明，中药抗病毒作用途径主要分为直接途径和间接途径两种。直接抗病毒作用是指病毒侵入前药物主要通过抑制病毒DNA、RNA的合成、阻止病毒的吸附及穿入[17]，直接灭活病毒来抑制病毒的增殖，同时药物也可阻止病毒由感染细胞侵染未感染细胞等多种途径来抗病毒。间接途径抗病毒则主要表现为促进免疫器官发育、增强细胞免疫和体液免疫、诱生干扰素以及多种细胞因子的综合调节及调节机体免疫功能等多种方式。而有些中药则通过直接和间接两种方式相结合更有效地达到抗病毒的效果[18-20]。所以，可根据中药不同的抗病毒作用机理，开发出相应的病毒进入抑制剂、病毒复制抑制剂、包装和组装抑制剂和免疫调节剂等抗病毒药物[21]。

3 中药抗BVDV的研究方法

测定抗BVDV活性常用的方法是利用BVDV在细胞培养体系中的感染和复制能力进行体外细胞试验检测，主要使用的细胞为MDBK细胞。中药抗BVDV目前研究内容主要包括：①病毒毒力的测定。采用细胞病变效应(CPE)，观察接毒后的细胞形态，根据细胞形态判断病毒导致细胞病变程度，运用Reed-Muench法计算半数细胞感染量，并计算出TCID50值来评定病毒毒力的大小。②采用细胞病变效应、染料吸收法，确定最大给药量。在安全给药剂量范围内，不同的加入方式(药物和病毒同时；先给药物，在37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育2 h后再加入病毒；先加入病毒，间隔2 h后再加入药物；先药物与病毒同加，然后再加药)来研究药物对病毒的直接灭活作用；药物对病毒的阻断作用；药物对病毒复制的抑制作用；药物对病毒的综合抑制作用。目前，使用评价药物抗BVDV活性效果的指标是通过细胞病变效应和染料吸收法。其细胞病变法主要是细胞接种药物和病毒后，以细胞病变程度为指标来衡量药物对病毒的作用，进而评价药物的抗病毒效果。染料吸收法包括MTT染色法和中性红染色法，两种方法均通过酶标仪测OD值，反映接种药物和病毒后的细胞在一定时间活细胞的数量的改变，通过抑制率确定药物抗病毒的效果及其药物抗病毒的作用方式。

4 中药抗BVDV的研究进展

自1946年起，西药已开始用于对BVDV感染引起的BVD疾病进行研究[22]。有关研究提出了利巴韦林能与干扰素(INF-α)联合应用能有效控制BVDV感染，但约40%会出现病毒学反应[23]。感染早期，BVDV对氯喹、氯丙嗪和金雀异黄酮、氯化铵等药物都比较敏感[24]。但至今，BVDV的感染仍不能通过西药得到理想的控制。而有些中药具有强效抗BVDV作用已被证实。

4.1 抗BVDV的中药成分

不同种类的中药抗BVDV的作用强弱具有显著性差异。金丝桃素为贯叶连翘的有效成分之一，为抗病毒的中药活性单体[25]，属于萘骈二蒽酮类化合物。郭志廷等[26]将金丝桃素制备成可溶性粉，在0.3 g/L～2.5 g/L范围内确定出金丝桃素对BVDV具有直接杀灭作用。选用西藏茎直黄芪来提取生物碱类成分苦马豆素(SW)，体外抗BVDV活性试验结果表明，苦马豆素对BVDV的综合抑制作用最佳，直接作用和抑制作用较好，而阻断作用不理想[27]。郝宝成[28]还进一步推测了苦马豆素发挥抗BVDV活性作用的途径可能是通过进入细胞内部对BVDV的复制产生抑制及直接灭活游离BVDV。沙冬青总黄酮部位具有显著的体外抗BVDV活性,药物浓度为0.188 mg/mL时，其对病毒直接杀灭作用非常显著，病毒抑制率高达89.44%[29-30]；沙冬青总生物碱(主要包括左旋黄花木碱、鹰爪豆碱、黄花碱、异黄花碱等)对抗BVDV活性研究证实，当药物浓度为0.32 g/L时，其抑制病毒复制的效果显著，抑制率达79.80%；沙冬青总生物碱浓度低于0.39 g/L时，可作为细胞保护剂促进细胞增殖[31-32]。此外，研究表明人参皂苷在浓度为1.60 μg/mL～ 80 μg/mL，五味子乙素浓度为0.44 μg/mL～19.35 μg/mL，鹿角盘多糖浓度为2 μg/mL～39 μg/mL时，不同成分、不同浓度的3种药物均对抗BVDV有显著的作用，且在安全剂量范围内，药物抗BVDV的作用强度与药物浓度的增加呈正相关[33-35]。

4.2 抗BVDV的中药复方

目前，国内外对于抗BVDV的复方中药研究较少。杨帆等[36]采用水提和醇提两种方法从具有抗病毒药物黄芩、黄柏、栀子等14味组方方剂中提取4种提取物，选用犊牛睾丸细胞进行体外抗BVDV活性研究。结果表明，4种提取物均对BVDV具有抑制作用，但其活性的强弱具有根据给药方式的不同，抗BVDV的作用药效强弱也不同。Wang J Y等[37]研究表明，黄芩栀子复方(黄芩、秦皮、栀子、大黄、牡丹皮、生地黄、诃子、石榴皮、厚朴、枳壳)治疗BVDV引起的牛腹泻疾病有效率高达95%，治愈率达75%。其中已证实黄芩、栀子在体外抑制BVDV在10味药物中占主导作用。此外，郑春丽[22]对黄芩栀子复方体外抗BVDV活性机制进行了探讨，结果表明，黄芩栀子复方可直接抑制BVDV的复制，并通过调节免疫功能发挥抗BVDV作用,同时推测中药也可能是通过调节干扰素来抗BVDV活性起到治疗BVD的作用。郜玉刚[38]选用黄芪注射液、鱼腥草注射液、莪术油注射液、双黄连粉针剂4种中药复方制剂对抗BVDV的有效性进行研究，通过对4种中药抗BVDV作用的强弱进行比较分析后发现，在不同的加入方式下其抗病毒的强弱不同,当采用药毒同加时，抗BVDV活性由强到弱依次是莪术油、鱼腥草、黄芪、双黄连，先加药后接毒时鱼腥草、莪术油、黄芪、双黄连效果依次减弱，先加病毒后加药物抗BVDV作用强弱顺序为莪术油、鱼腥草、黄芪、双黄连。

5 小结

BVDV引起的病毒性疾病危害巨大，当缺乏疫苗和治疗标准时，发现有效且具有成本效益的药物对于控制病毒十分迫切。现有研究表明中药体外抗BVDV活性显著，具有较好开发潜质。但目前国内外对于抗BVDV的中药及复方研究较少，尚存在很多科学问题需要研究，如中药及复方对于不同生物型的BVDV作用是否存在差异，在动物体内是否亦会发挥显著抗BVDV作用，其抗BVDV的作用靶点如何确定等。充分利用快速发展的现代生物技术，建立合理科学的试验方法与监测指标，针对病毒感染的不同环节进行深入研究，并使体内与体外评价、基础与临床研究密切配合，开发出具有我国自主知识产权的符合国际标准的抗BVDV药物。

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