细胞自噬对造血干细胞的影响研究进展

张 迪，曾梦颖,闫晓霞，严玉霖，高 洪

(云南农业大学动物科学学院，云南昆明 650201)

老化是许多疾病发生的最大危险因素。生理老化是一个复杂的多因素过程，受遗传和环境因素的调节。虽然整个身体中的组织以不同的方式受到影响，但出现老化的一个共同特征就是组织功能水平的降低，这一现象通常与干细胞活性的降低有关[1]。血液系统在维持机体健康的各个方面都发挥着重要作用，并且维持血液生成依赖于造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)自我更新并分化为成熟血细胞所有谱系的的能力。

研究表明,造血干细胞自噬能力的损失会导致线粒体的积累使细胞处于一种活化的代谢状态，其主要通过调控表观遗传驱动来加速骨髓分化，影响造血干细胞自我更新活动并损害其再生潜力。成年小鼠中的大部分造血干细胞的代谢和功能特征都会发生改变。然而，大约三分之一的成年造血干细胞具有类似于健康的年轻造血干细胞的强大的长期再生潜力，表现出高自噬水平和低代谢状态。相关研究结果表明,自噬通过清除活跃、健康的线粒体抑制造血干细胞代谢，保持稳态和干性，随着年龄增长，维持老的造血干细胞的再生能力变得越来越重要[2]。论文就近些年来自噬在造血干细胞的特性维持方面的相关研究进展进行综述，目的是揭示自噬对造血干细胞的重要性，提高对于自噬在干细胞生物学功能中作用的认识。

1 细胞自噬及其分子机制

自噬(autophagy)是细胞内的一种“自食(self-eating)”的现象，是指膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体(autophagosome)，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体(autopholysome)，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新[3]。当机体缺乏营养或产生其他应激原时，细胞自噬通过分解衰老的细胞器和变性的生物大分子为细胞的生存提供物质和能量支持。目前根据发生过程将自噬分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy，CMA)。

巨自噬(macroautophagy)即我们说的自噬(autophagy)。Macroautophagy是进化上保守的细胞过程，特征是会形成自噬体双膜囊泡。通过该过程细胞将其细胞质和细胞器的一部分隔离成双膜囊泡，称为自噬体，随后与溶酶体融合以降解封闭内容物。自噬体形成由一系列蛋白质复合物控制，包括用于诱导自噬的ULK1-ATG13-RB1CC1/FIP200C12或f44/ATG101复合物，引发自噬体形成的Ⅲ类磷脂酰肌醇(PtdIns)3-激酶复合物(包括BECN1、ATG14/ATG14L/BAGOR、PIK3R4/VPS15、PIK3C3/VPS34和AMBRA1)，以及自噬体双膜的延伸和闭合所需的ATG12-ATG5-ATG16L1复合物和MAP1LC3A/LC3(ATG8同源物)-磷脂酰乙醇胺(PE)复合物(两种泛素样缀合系统)[4]。除了这些核心成分外，还有许多其他以酵母为特征的自噬相关基因(autophagy associated gene,ATG)及其哺乳动物直系同源物也是自噬需要的。自噬相关基因参与调节自噬起始和延伸等过程[5]。

自噬传递信号通路包括起抑制作用的Class Ⅰ PI3K pathway(PI-phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇)、mTOR pathway(mammalian target of rapamycin)和激活自噬的Class Ⅲ PI3K通路，它在结构上类似于Class Ⅰ PI3K，但作用相反[6]。

细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测。由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需采用透射电镜技术。吞噬泡(phagophore)的特征为新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(autophagic vacuole，AV1)的特征为双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为单层膜，胞浆成分已降解。

由于电镜检测耗时长，不利于监测(monitoring)自噬形成，人们利用微管相关蛋白轻链3(microtu-buleassociated protein light chain 3，MAP-LC3，简称LC3)在自噬形成过程中发生聚集的现象在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，1个斑点相当于1个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-Ⅰ)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-Ⅱ)，因此，可以利用Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值的变化来评价自噬水平的高低。另外，LC3抗体对LC3-Ⅱ有更高的亲和力，会造成假阳性。因此，GFP-LC3融合蛋白和Western blot需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响[7]。

2 造血干细胞的功能特性

1961年Till J E、McCulloch E A用小鼠体内脾结节方法第一次证实了造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的存在。20世纪80年代后，Weissman等多个实验室相继通过细胞表面标记分离出高度纯化的不同阶段的造血干/祖细胞。在小鼠造血干细胞的研究中，造血干细胞的分离是通过细胞表面标记Lineage Sca-1c-kit或者细胞代谢方面的特性(侧群细胞)借助于流式细胞仪实现的。20世纪90年代通过引入CD34这个细胞表面标记区分小鼠中长期造血干细胞和短期造血干细胞。进入21世纪后，基于SLAM家族分子(CD41，CD48和CD150)进一步富集造血干细胞，SLAM分子在造血干细胞的表达比较稳定，并且能够广泛的应用于各品系的实验小鼠。人HSC表面标记研究也同步发展，目前使用比较广泛的人的造血干细胞表面标记为LineageCD34CD38[8]，其中造血干细胞强表达的表面标志分子为CD34+。

造血干细胞又称多能造血干细胞，是存在于造血组织中的一群原始造血细胞，也可以说它是一切血细胞(其中大多数是免疫细胞)的原始细胞。它是发现最早、研究较多、在临床中广泛应用的一类重要的成体组织干细胞，具有自我更新、多向分化、静息维持、凋亡控制和运动迁移这五大特性。造血干细胞定向分化、增殖为不同的血细胞系，并进一步生成血细胞。人类造血干细胞首先出现于胚龄第2周～第3周的卵黄囊，在胚胎早期(第2月～第3月)迁至肝、脾，第5个月又从肝、脾迁至骨髓。在胚胎末期一直到出生后，骨髓成为造血干细胞的主要来源。在胚胎和迅速再生的骨髓中，造血干细胞多处于增殖周期之中；而在正常骨髓中，则多数处于静止期(G0期)，当机体需要时，其中一部分分化成熟，另一部分进行分化增殖，以维持造血干细胞的数量相对稳定。当机体失血或者需要补充正常生理代谢过程中消耗的血液细胞时，HSC才会重新进入细胞周期。HSC静止、自我更新和分化之间取得了很好的平衡，当这种平衡被打破时，会产生一些严重的后果，如造成某些谱系的偏差分化，从而消耗或过度表达(如贫血、淋巴细胞减少、骨髓增生)或形成造血恶性肿瘤(如白血病)。血液系统中的成熟细胞寿命极短，因此在动物的一生中，造血干细胞需要根据机体的生理需求适时的补充血液系统各个成熟细胞组分。同时在损伤、炎症等应激状态下，造血干细胞也扮演着调节和维持体内血液系统各个细胞组分的生理平衡的角色。

因为造血干细胞有分化为其他细胞的能力，因此造血干细胞在治疗疾病方面发挥着巨大的作用，常见的是造血干细胞移植。造血干细胞移植是经大剂量放疗、化疗或其他免疫抑制剂进行预处理，清除移植受体体内的病理细胞(肿瘤细胞、异常克隆细胞、病态造血细胞)或阻断发病机制，然后把异体或自体的造血干细胞移植到受者体内，以重建受者的正常造血及免疫功能，达到治疗疾病目的的治疗手段。目前的造血干细胞移植分为骨髓移植、外周造血干细胞移植、胎肝造血细胞移植和脐血造血干细胞移植等。骨髓移植主要用来治疗急慢性白血病、严重的再生不良性贫血、地中海性贫血、淋巴瘤、多发性骨髓瘤[9]等，现在还用于治疗转移性乳腺癌和卵巢癌等的尝试。外周造血干细胞移植多用在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤和乳腺癌等实体瘤的治疗[10]。脐血造血干细胞可以用来治疗多种血液系统疾病和免疫系统疾病。另外，已有研究发现自体造血干细胞移植对于治疗1型糖尿病有一定的疗效。

3 细胞自噬与造血干细胞的关系

维持细胞健康和预防干细胞衰老对造血健康至关重要，自噬在降解受损分子和细胞器中的作用对于保持细胞年轻化很重要。因此，自噬与老化有着密不可分的联系：①自噬水平通常随多种细胞类型(包括造血细胞)的年龄增长而降低；②ATG基因突变功能的丧失将缩短酵母的寿命[11]；③热量限制和雷帕霉素的使用可以增加线虫和大鼠的寿命；④小鼠自噬基因的组织特异性丧失将导致年龄相关疾病的发生，如神经退行性疾病、糖尿病和癌症[12]。来自老年小鼠的HSC显示出每个细胞的再生活性降低、自我更新和归巢能力减弱，骨髓偏向分化和应激诱导的细胞凋亡水平的增加。以上这些现象在ATG7或RB1CC1/FIP200基因缺陷的小鼠HSC细胞中都可以观察到[13-14]。FIP200(200 ku黏着斑激酶家族相互作用蛋白)被证明是不仅对于自噬的诱导，而且对体内HSC的维持和功能也是至关重要的[15]。选择性敲除小鼠造血系统Atg7基因，显示LSK(谱系阴性、Sca-1阳性、c-kit阳性)细胞累积异常线粒体，ROS水平升高，并显示过度的DNA损伤，导致HSC的丧失，即小鼠的正常造血功能丧失，出现严重的髓性增生，并于数周内死亡[16-17]。

HSC进入静息通常与代谢变化相关。虽然增殖细胞将其大部分代谢能力用于生物合成，以便产生形成新细胞所需的材料，但静息状态的细胞可以缓解大量的代谢需求。HSC在非分裂期间下调蛋白质合成并激活维持它们的途径，除Cyclodindependency激酶抑制剂外，通过PtdIns3K-mTOR途径调节静止期[18]。实际上，mTOR活性增加对HSC有不利影响，包括HSC的过度增殖会导致白血病，其次是干细胞衰竭和造血谱系不能再生。有数据表明HSCs可以通过抑制mTOR信号恢复老年小鼠的自我更新和造血活力，并能够通过接种流感疫苗来恢复[19]。总体而言，这些结果表明，自噬缺失型HSC和具有缺陷型自我更新活性和骨髓偏向分化潜能的oHSC之间存在明显的相似性，并且证明自噬对处于老化过程和再生应激条件下(如移植)的HSC功能至关重要。

Gata-1是调节造血干细胞红系分化的重要转录因子。近期发现，Gata-1能够激活细胞自噬相关基因LC3b、ATG、MAP1-LC3A、GABARAP、GABARAPL1的表达。随着造血干细胞红系分化成熟，Gata-1表达增加，细胞自噬相关基因表达增加，细胞自噬功能增强，通过细胞自噬清除细胞器，最终形成无细胞器的成熟红细胞。Wnt信号通路在维持造血干细胞自我更新能力方面起重要作用。mTOR通过抑制自噬体的形成抑制细胞自噬。mTOR是Wnt信号通路重要的转导分子，Wnt信号通路通过激活mTOR抑制细胞自噬[20]。

Notch信号通路对造血干细胞命运决定及其产生发挥着细胞自主性调控作用。在造血干细胞分化期间，ROS逐渐增加。抑制ROS产生会减少造血干细胞的分化[21]。在野生型小鼠的造血干细胞和祖细胞(progenitor cells，HSPC)中，抑制ROS产生，自噬活性下调，但细胞内Notch及其下游效应上调。相比之下，在自噬完全缺陷小鼠的HSPC中，ROS抑制不改变骨髓分化，造血干细胞分化为多谱系不再响应于ROS抑制。在代谢过程中产生的线粒体ROS会触发自噬下调细胞内Notch通路，从而促进造血干细胞的分化。因此，自噬可以通过直接靶向Notch来调节造血干细胞的分化维持造血[22-23]。

事实上，现有资料表明干细胞的独特性质(自我更新、多能性、分化和静止)取决于自噬过程的活化[24]。首先，自我更新和分化的过程需要严格控制细胞重塑，其涉及蛋白质周转和细胞器的溶酶体降解。其次，受损大分子物质和细胞器的消除及更替是保持长寿命干细胞处于长时间静止期时的多能性所必需的。最后，基底自噬是一种稳态过程，其调节质量控制、清除细胞内变化和受损伤的蛋白质和细胞器，以及通过降解结构成分进行细胞重塑。现在有越来越多的证据表明自噬在胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESC)、几种组织干细胞，特别是造血干细胞(HSCs)以及许多癌症干细胞(cancer stem cells，CSCs)的调节中起主要作用。自噬除了作为维持干细胞干性和自我更新的重要机制之外，还参与了各种干细胞及其后代的分化调节过程。

4 小结与展望

越来越多的研究数据表明,自噬与造血干细胞的特性有密切关系。静止状态下HSC中的细胞受损成分只能通过细胞自噬来清除并继续维持静息状态。生理状态下，造血干细胞内的自噬对于维持正常的造血至关重要，但是细胞自噬对于造血影响的另一面也同样不可忽视，某些病理条件下，过度激活的细胞自噬也会导致HSC的耗竭。因此研究造血干细胞与自噬之间的相互关系，可以为维持造血干细胞的干性，增强其分化能力提供一个研究方向。

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