干酪乳杆菌的免疫及其作为载体的应用研究进展

刘欢欢，李树东，王珊珊，高国强，余丽芸，侯喜林*

(1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学生命科技学院，黑龙江大庆 163319)

干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)属于乳杆菌属(Lactobacillus)，革兰阳性菌，在动物和人类肠道中广泛存在[1]，与嗜酸乳杆菌和双歧杆菌共称为益生菌界的“健康三益菌”，我国卫生和计划生育委员会于2001年将其认定为保健益生菌菌种[2]。

干酪乳杆菌对诱发黏膜和全身免疫具有类似佐剂的作用，可提高耐受乳糖的能力；减少胃肠道病原体；减少结肠、直肠癌的发生；降低感冒发生频率及炎症相关疾病如溃疡性结肠炎症状等[3]。研究发现，改善宿主健康状况可以通过改变肠道微生物群来实现[4]，以干酪乳杆菌为例发现，服用干酪乳杆菌作为微生态制剂可改变肠道中的微生物群并影响宿主免疫应答[5]。另外，随着分子生物学的发展和电转化转基因技术的成熟，以益生菌作为抗原递呈载体进行黏膜免疫疫苗的研究，逐渐成为近年来对该领域研究的前沿和热点[6]。本文将对干酪乳杆菌刺激机体产生的特异性和非特异性免疫及其作为抗原递呈载体的应用进行综述。

1 干酪乳杆菌的耐受能力

干酪乳杆菌在体内发挥免疫功能，但是机体过酸过碱的环境可能会影响其活性从而影响干酪乳杆菌的功效。因此，能否顺利通过胃肠环境并成功定植于肠道黏膜以实现对机体的免疫功能，成为干酪乳杆菌应用于实践的重要依托。徐义刚等[7]对此进行了试验验证，分别在体外进行了人工胃液耐受试验、胆汁耐受试验和耐盐试验，证明重组干酪乳杆菌在人工胃液消化3 h后活菌数可达108/mL左右；在人工肠液存在明显的生长趋势；在盐浓度高达3 mg/mL的胆汁可缓慢生长，对高盐环境具有较强耐受能力，说明干酪乳杆菌可耐受机体强酸强碱环境且具备良好的存活能力。

2 干酪乳杆菌诱发的机体免疫

干酪乳杆菌的免疫途径如下：一种是以刺激单核吞噬细胞、活性氧、溶酶体和单核因子等分泌为主的非特异性免疫；另一种则为诱发机体增加黏膜表面和血清中IgA、IgM、IgG水平，激活宿主免疫细胞，促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，诱导产生大量细胞因子如白介素-1( interleukin-1,IL-1)、白介素-6( interleukin-6,IL-6)及白介素-12( interleukin-12,IL-12)等为主的特异性免疫[8]。

2.1 非特异性免疫

抗菌肽(antimicrobial peptide，AMP)作为先天性免疫系统中肠道黏膜防御的重要组成部分，在塑造肠道微生物群的组成中具有重要作用[9]。Aktas B等[10]分别对7种干酪乳杆菌进行了试验测定，结果表明干酪乳杆菌菌株在改善肠道微生物组成的同时与AMP调节和模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)调节之间存在一定关系。Jr B M等[11]发现，服用干酪乳杆菌可降低干扰素及炎性因子的产生，刺激白介素-10(interleukin-10,IL-10)的表达量显着增加(P<0.05)，IL-10可抑制促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的产生，调节宿主的炎症反应，导致Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)表达量降低，TNF-α的含量随之降低[12]。这些都表明，干酪乳杆菌的使用可刺激小鼠产生抗炎作用，但其程度和机制存在菌株特异性[10]。Takeda K等[13]证明干酪乳杆菌Shirota株可通过乳制品的摄入而增强自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)活性。Compare D等[14]构建了离体肠道微生物群，并对感染后肠应激综合征(post-infectious irritabIe bowel syndrome,PI-IBS)进行了试验分析。研究发现，干酪乳杆菌在影响IBS症状上发挥了积极的作用，使用干酪乳杆菌DG株治疗后显着降低了所有促炎性细胞因子的mRNA以及Toll样受体4(Toll-like receptors 4,TLR-4)蛋白的表达水平，同时增加了回肠和结肠中抗炎性因子IL-10的mRNA水平。

2.2 细胞免疫

干酪乳杆菌作为抗原入侵机体后可刺激机体产生相应的免疫应答，首先激活巨噬细胞等单核细胞，进而通过增强T细胞或NK细胞活性来提高机体免疫力。研究发现，由干酪乳杆菌处理的Ercc1-/Δ7小鼠的肠系膜淋巴结的T细胞数显著增加，动物体内依赖T细胞免疫的特异性抗体也随之增多，相比之下，对照组小鼠所产生的影响可忽略不计[15]。Dong H等[16]的研究已经确定，干酪乳杆菌Shirota可促进自然杀伤细胞活性，激活细胞毒性T淋巴细胞，有效清除体内被病毒感染的细胞，减少病毒复制，增加抗病毒抗体的含量。

2.3 体液免疫

干酪乳杆菌可提高哺乳小鼠体内针对β清蛋白的抗体水平，增加对致敏红细胞(sensitization red blood cell,SRBC)敏感的小鼠体内的IgM含量。口服干酪乳杆菌Shirota株的挪威鼠可产生抗原特异性迟发型超敏反应，并增加血清中IgG2b的含量[17]。补充干酪乳杆菌的Ercc1- /Δ7小鼠，可在抗原攻击后，促进其血清中IgG2a的抗体滴度显著增多[15]。

2.4 黏膜免疫

干酪乳杆菌诱导机体发生黏膜免疫应答时，可通过小肠上皮细胞之间的甲基纤维素(methyl cellulose,MC)或上皮树突状细胞(dendritic cells,DC)两种途径到达肠组织固有层，然后活化Th2淋巴细胞，分泌大量的白介素-5(interleukin-5,IL-5)导致B淋巴细胞活化，分泌特异性抗体IgA。特异性抗体IgA与肠黏膜上皮的分泌片特异性结合，从而形成黏膜表面抗体sIgA，进而防止病原菌的黏附及入侵等[18]。宿主肠上皮屏障功能依赖于肠道紧密连接蛋白的水平和分布[19]，大多数干酪乳杆菌菌株可通过促进该蛋白表达量的增加来增强肠上皮屏障功能[20]，通过增加炎症受体(CD-206和TLR-2)的表达水平实现肠黏膜免疫系统的活化[21]。

3 干酪乳杆菌作为表达载体的应用

与研究较为成熟的大肠埃希菌(Escherichiacoli)或巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统相比[22]，乳酸菌特别是乳杆菌表达系统尚处于研究阶段，其作为表达载体的独特优势已成为近些年的研究热点。乳酸菌作为公认的食品级安全菌株，其构建的重组菌株表达的蛋白无需经过纯化即可应用于饲料添加剂等食品级用途[23]，使用其作为黏膜递呈载体可以表达同源和异源蛋白质[24]。许多研究者应用干酪乳杆菌已成功表达了病毒、细菌及哺乳动物多种来源的异源蛋白。

干酪乳杆菌作为乳酸菌的一员，能够耐受机体的防御机制，通过口服途径摄入后，大部分菌体可耐受胃液、肠液的消化作用，在肠道内大量存活，通过与肠道黏膜紧密接触，起到调节肠内菌群平衡、促进机体消化吸收的作用。同时某些菌株已被证实具有降血压、降胆固醇，抗过敏，增强机体免疫等益生功能[25]，因此干酪乳杆菌作为活菌疫苗抗原递呈载体越来越受到科研人员的重视[26]。除此之外，在诱导黏膜免疫方面，干酪乳杆菌比其他活疫苗载体如志贺菌，沙门菌和李斯特菌更具竞争力。目前，使用乳杆菌属作为活疫苗递送载体构建的重组疫苗，已经针对多种微生物抗原产生了黏膜免疫[27-28]。

人兽共患类疫病一直是危害包括人和各种的动物的重要病原体，其中产气荚膜梭菌、流感病毒及产肠毒素性大肠埃希菌作为高发性病原菌一直是困扰研究人员的难点问题，而寻找一种有效的防控手段则成为目前的研究重点。

产气荚膜梭菌产生的α毒素是引起人、动物和家禽坏死性肠炎的重要毒力因子之一。通过构建重组的干酪乳杆菌表达载体免疫小鼠后，其血清中IgG和IgA抗体与肠道中分泌的sIgA抗体水平明显高于对照组，在此基础上，宫旭颖[29]将产气荚膜梭菌的4种主要外毒素α、β1、β2和ε同时插入干酪乳杆菌重组体系使4种异源蛋白同时表达，实现经过1次免疫接种，就可同时预防多型产气荚膜梭菌感染引起的疾病，证明了干酪乳杆菌重组体系对产气荚膜梭菌高水平的保护效力。

针对甲型流感灭活疫苗刺激机体抗体水平大幅度下降的情况，Suebwongsa N等[30]通过构建大肠埃希菌-干酪乳杆菌穿梭载体，改造干酪乳杆菌TISTR1341株成功表达甲型流感病毒的核衣壳蛋白，同时在对干酪乳杆菌TISTR1341株的克隆载体pRCEID-LC7.6的适用性研究中发现，新载体也能克隆和表达来自甲型流感病毒的核衣壳蛋白，为其成为口服免疫的黏膜递呈载体提供有力依据[31]。在甲型流感病毒保守蛋白M2的研究中，Jimenez G S等[32]构建了多种重组疫苗，包括表达M2融合蛋白的重组E.coli，表达M2蛋白的腺病毒载体，编码M2的质粒DNA等，其中每一个都能够在小鼠体内引发保护性免疫应答，然而，这些基于M2蛋白的疫苗都存在免疫原性低的问题。研究发现，如果抗原可诱发黏膜免疫，将比体外免疫获得更高的保护效力[33]。针对此现象，Chowdhury M Y等[34]融合交叉免疫的思路，采用与流感病毒同样具有M2蛋白基因的霍乱毒素作为研究对象，并将编码霍乱毒素M2蛋白的基因作为目的片段与干酪乳杆菌表达体系构建重组载体免疫小鼠，口服免疫的小鼠体内γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素-4(interleukin-4,IL-4)表达水平明显增高，通过鼻黏膜免疫可比口服免疫表现出更高的血清IgG和黏膜IgA表达水平。随着研究的进一步推进，Suebwongsa N等[30]对甲型流感病毒核衣壳蛋白(NP)的密码子进行了优化，将优化后的NP蛋白基因与干酪乳杆菌进行重组，发现其可以改善异源蛋白表达效率低的问题，获得更高水平的异源蛋白表达。

Liu J K等[35]将表达ETEC F41的重组干酪乳杆菌口服免疫小鼠，产生明显的抗F41的IgG和sIgA抗体，且口服主动免疫组保护率达90%以上。Martín MC等[36]通过将Norwalk病毒VP60基因插入干酪乳杆菌构成重组系统，同样表现出了较高水平的保护效力。

以上这些结果都表明，较之前免疫手段相比，干酪乳杆菌重组载体的构建，对以上几种高发性的人兽共患疫病的发生提供了更好地抵抗效果，因此，该载体的进一步研究成为了日后彻底消除此类疫病的希望所在。

猪腹泻类疾病作为养猪行业的多发疾病，一直以来困扰着研究人员，而如何有效的防控此类疾病则成为目前研究的关注重点。

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)主要通过肠道感染猪，在抗PEDV感染的免疫过程中，局部肠黏膜免疫系统发挥着不可替代的作用。葛俊伟等[37]通过将PEDV的中和抗原位点基因COE插入到干酪乳杆菌表达载体，构建了表达PEDV中和抗原位点的重组干酪乳杆菌，以此获得抗PEDV口服活载体疫苗，将其免疫小鼠诱导产生了高水平抗体IgG和黏膜抗体sIgA，并促进产生淋巴细胞，与现有疫苗相比，在黏膜免疫方面具有明显的优越性。

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)可引起仔猪严重腹泻，病死率很高，Ho P S等[38]利用重组干酪乳酸杆菌表达传染性胃肠炎病毒刺突状糖蛋白以诱导特异性抗体，通过口服免疫小鼠，在其血清和肠液中检测到高水平的针对TGEV的特异性IgG和IgA，使得接种疫苗的小鼠获得了较好的免疫保护效果。王桂华等[39]将猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的抗原表位A片段插入到干酪乳杆菌表面表达载体pLA上，将构建的pLA-A-GFP重组质粒电转化到干酪乳杆菌中，口服免疫小鼠，试验组小鼠与照组相比，分别在免疫2周和3周后检测出更高的IgG和sIgA，表现出较高的保护效力。

周晗等[40]通过将猪轮状病毒主要免疫保护性抗原基因VP7和突变前非结构蛋白4区(NSP4)基因定向插入到干酷乳杆菌表面，构建了重组乳酸杆菌系统，通过口服方式免疫重组干酪乳杆菌后，在小鼠粪便、外生殖道冲洗液中均检测到了特异性sIgA抗体，在小鼠血清中检测到了特异性的IgG抗体。小鼠外生殖道和粪便中的sIgA以及血清IgG水平与对照组相比存在显著差异。

以上研究表明，引起猪腹泻类疫病的防控通过干酪乳杆菌重组疫苗的研究，已经取得了极大的进展，而这种主要从黏膜屏障上起防控作用的手段或许会是将来针对猪腹泻类疫病预防的最佳方式。

幼禽免疫一般以口服或滴鼻点眼的手段为佳，但传统疫苗采用该手段常造成免疫效力不佳的现象发生，因此促进了以乳酸菌作为递送载体的研究。

林红丽等[41]利用干酪乳杆菌作为传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白的抗原递呈载体，构建了重组干酪乳杆菌，分别通过口服、滴鼻或点眼等方式免疫小鼠，在都可诱发免疫保护的情况下，口服组免疫效果明显优于其他两组，且保护率高达83.3%。孙景秀等[42]证明新城疫病毒(NDV)HN蛋白重组干酪乳杆菌表达体系可诱导产生高水平的雏鸡黏膜免疫应答。才冬杰等[43]构建的J亚群禽白血病病毒gp85基因重组的干酪乳杆菌在免疫7周后，进行攻毒保护性试验，结果发现，重组干酪乳杆菌pMG36e-gp85/L.casei免疫雏鸡后能够明显增强体内抗体水平；对照组病毒血症平均检出率为86%，而口服组和滴鼻组病毒血症平均检出率为40%和55.2%。结果表明，构建的重组干酪乳杆菌pMG36e-gp85/L.casei对禽白血病病毒具有一定的抵抗力。付锦楠等[44]将编码减蛋综合征病毒的主要免疫保护性抗原纤维蛋白KnobS基因与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)基因插入干酪乳酸杆菌分泌表达载体pMG36e-UP/L中，成功构建重组表达载体，并可成功表达融合蛋白KnobS-LTB。构建的干酪乳杆菌抗原递呈载体不仅可以刺激产生先天性和特异性免疫应答，还可以诱发高水平的黏膜免疫应答，与其他抗原递呈载体相比，表现出了更高的保护效率，从以上的研究可以发现，以干酪乳杆菌作为抗原递呈载体可更好地弥补传统疫苗的不足，从相关实例上更好地体现了干酪乳杆菌重组体系的应用价值。

由上述研究成果可以看出，以干酪乳杆菌作为抗原递呈载体研制出的疫苗，多以防治动物消化道疾病为主。当其进入机体刺激较强的黏膜免疫应答，产生大量的sIgA的同时，还具有食品级的安全性保障，为临床的实际应用提供了可行性，具有极高的研究价值，与其他抗原递呈载体相比具有一定优势。

4 小结

动物疾病的防治工作一直是研究工作者的关注重点，研究发现，动物患病多数因为病原体通过黏膜途径侵入机体，如消化道、呼吸道和泌尿生殖道黏膜，从而导致动物染病，因此黏膜免疫对抵抗病原体入侵机体具有十分重要的意义[45]。黏膜免疫不仅可以产生IgG，还可以刺激产生大量的sIgA，sIgA的免疫屏障作用可阻隔病原菌的侵入或阻止病原菌与上皮细胞受体的结合，从而加强黏膜的抗感染能力[46]。已经证明了干酪乳杆菌是有效的肠道益生菌，大量的试验都表明了它的摄入可以刺激机体产生较高水平的特异性和非特异性免疫应答，以提升动物机体免疫力。研究人员将干酪乳杆菌用作目的基因的抗原递呈载体研制的重组疫苗，可以耐过胃液和肠液的酸碱环境，通过口服的方式免疫动物，操作方便、简单且减少了动物因注射疫苗引起的应激现象的发生，承载了抗原的干酪乳杆菌表达体系进入机体后，可定植于肠道，产生传统疫苗不能诱发的肠道黏膜免疫应答，并长期存在于肠道，因此可作为引起腹泻症状疾病预防和治疗的首选方案。

由于对干酪乳杆菌作为抗原递呈载体的研究仍在进行中，所以亟需解决一些可能出现的实际问题，如干酪乳杆菌作为目的基因抗原递呈载体制备的疫苗免疫效果是否与预期结果相符，以及对于其临床应用的实际效果如何仍需要更多的生产实践来验证，另外，干酪乳杆菌重组体系是否能规避免疫耐受现象也未经证实，一旦证明干酪乳杆菌可作为抗原递呈载体的实用性，它将因其自身优势而拥有广阔的应用前景。

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