26味中药对狐源致病性大肠埃希菌地方株体外抑菌试验

张召兴，肖丽荣，李巧玲，李蕴玉，李佩国，吉志新，岳香云，贾青辉，史秋梅

(河北科技师范学院/河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛 066604)

大肠杆菌病是由某些致病性大肠埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)菌株引起多种动物及人不同疾病的总称，大肠埃希菌广泛存在自然界中，可以感染猪、鸡、狐狸、貉、貂等多种动物，引发不同的症状，是一种人畜共患重要的条件致病菌[1-2]。狐狸致病性大肠埃希菌主要感染断奶前后的幼兽，多呈暴发流行并有一定的季节性，临床以败血症和腹泻为主，感染率和病死率均较高，还侵害中枢神经系统和呼吸系统，成年和老年的狐狸很少发病，成年母狐感染致病性大肠埃希菌会引起流产和死胎，造成严重的经济损失[3]。

近年来，在养殖过程中抗菌药物的不合理使用，导致了致病性大肠埃希菌产生很强的耐药性，是许多敏感的抗菌药物变为不敏感或多重耐药，并且导致大量的抗菌药物在动物体内的残留，给人类的健康造成严重的危害[4-6]。中草药富含有多种化学成分，不仅具有抗菌、增强免疫力、抗炎、抗内毒素多种药理作用，还具有无副作用、低残留、不易产生耐药性等多种优点[7]。中草药药理作用复杂，对动物机体具有双向调节作用，通过多个途径调解机体的功能状态[8]。中草药在防治畜禽疾病中被广泛应用，因此，本研究通过测定26味中草药对狐狸E.coliHL2(O1)地方菌株的体外抑菌活性，为进一步研发防治狐狸致病性大肠杆菌病复方中草药制剂及临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 狐狸致病性E.coliHL2(O1)地方株及标准菌株ATCC25922，由河北省预防兽医学重点实验室保存。

1.1.2 主要试剂与仪器 五味子、诃子、金银花、黄连等26味单味中草药，购自秦皇岛民乐医药有限公司; 普通培养培养基、营养肉汤，北京奥星生物技术公司产品；96孔细菌培养板，美国Corning公司产品；10 g/L红四氮唑，美国Corning公司产品；普通粉碎机，青州市精诚医药装备制造有限责任公司产品；YT-CJ-1D型超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司产品;GHP-9080型隔水式恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品;常规试剂及仪器，河北省预防兽医学重点实验室提供。

1.2 材料

1.2.1 单味中草药药液的制备 参照文献[9]的方法，用水提法制备的中草药药液，取26味中草药，用普通粉碎机粉碎后称量50 g，加入5倍～0倍的蒸馏水浸泡1 h～1.5 h，煮开后用文火再煎煮30 min，用12层纱布过滤，再加入5倍蒸馏水煮沸，用文火再煎煮20 min过滤药液。将两次所煮药液合并进行浓缩为每毫升含原药为1 g。离心后并调整其pH为7.2～7.4之间，分装，121℃灭菌10 min,4℃保存备用。

1.2.2 菌液的制备与计数 将HL2(O1)地方株与标准菌株ATCC25922的菌种接种于营养琼脂培养基中，将接种好的培养基置于37℃的恒温箱中培养12 h，挑取单菌落接种于肉汤培养基中，置于37℃振荡培养，每隔2 h用分光光度计在600 nm测其OD值，确定细菌的对数期，利用平板计数法进行菌落计数，调整菌液浓度108CFU/mL。

1.2.3 单味中草药体外抑菌圈直径的测定 参照文献[7]的方法，用平板打孔法测定26种单味中草药抑菌圈直径，取对数期的菌液0.1 mL(108CFU/mL)均匀涂布在平板上，待完全吸收后用直径6 mm的打孔器打孔，并加满中草药药液，置37℃培养箱培养12 h～16 h，每种药物3个重复，取平均值；判定标准为：10 mm<抑菌直径为低敏；10 mm≤抑菌直径<15 mm为中敏；15 mm≤抑菌直径<20 mm为高敏；20 mm≤抑菌直径为极敏。

1.2.4 单味中草药MBC的测定 参照文献[8]的方法，采用改良微量二倍法测定26种单味中草药的最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)。用96孔细菌培养板，第1～10孔加入100 μL灭菌水，在第1孔中加入100 μL中草药药液混匀后取100 μL加入到第3孔中，以此类推到10孔，在第3孔混匀后取100 μL混合液加入第4孔，以此类推，到第9孔混匀后弃去100 μL。在第1～11孔中分别加入100 μL 2×NB，第10孔不加药做为阳性对照孔，第11孔不接菌做为阴性对照孔。在第1～10孔接种10 μL(108CFU/mL)对数期的菌液，每种药物3个重复，每孔分别加入5 μL红四氮唑(10 g/L)，置37℃培养箱培养24 h，若颜色变红则说明有细菌生长。用无菌棉签分区划线法，无菌生长的区域则为各中药的MBC。

2 结果

2.1 单味中草药抑菌圈直径测定结果

由表1可知，狐狸致病性E.coliHL2(O1)地方菌株对五味子、诃子2种药物为极度敏感；对金银花、黄连、苦参3种药物高度敏感；对板蓝根、黄芩、五倍子等10种药物中度敏感；对地丁、白头翁、连翘、穿心莲4种药物低度敏感，对女贞子、蒲公英、大青叶等7种药物不敏感。

表1 中药对狐狸致病性E.coli HL2(O1)地方株体外抑菌试验

注：-.无效果。

Note：-.No effect.

2.2 单味中草药MBC结果

由表2可知该菌对五味子、诃子、金银花3种药物的MBC在7.825 mg/mL～15.65 mg/mL之间；对黄连、五倍子、苦参3种药物的MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL之间；对五倍子、苦参2种药物的MBC在31.25 mg/mL；对黄芩、板蓝根、沙棘5种药物的MBC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之间；对白头翁、黄柏、马齿苋5种药物的MBC在125 mg/mL～250 mg/mL之间；对夏枯草、连翘、穿心莲3种药物的MBC在250 mg/mL～500 mg/mL之间。女贞子、蒲公英、大青叶等7种药物对该菌则无效果。

表2 中药对狐狸致病性E.coli HL2(O1)地方菌株的MBC

注：-.无效果。

Note：-.No effect.

3 讨论

致病性大肠埃希菌可以引发多种动物及人发病，不同动物感染致病性大肠埃希菌引起不同的病症，尤其对幼龄动物比较易感，该菌血清型比较多，因地区而异致病力也有所不同，大肠杆菌病已经成为了危害健康养殖的主要传染病之一[1]。在养殖过程中，临床大多采用抗菌药物进行防治致病性大肠埃希菌，由于抗菌药物大量不合理使用，不仅会破坏动物肠道先天免疫力，引起肠道内菌群失调，还容易形成耐药菌株，同时也造成大量的药物残留[10-11]。 中草药中富含多种化学物质，这些性物质在动物体内不仅对病原菌有直接或者间接杀灭作用以及消除病原菌的耐药性，还可以调节整个动物机体免疫系统，提高机体免疫力，具有双向调节作用[12]。相关文献报道了中草药可以中和病原菌在动物产生的内毒素，促进动物机体毒素的排泄[13]。许多研究证实中草药的不同成分对致病性大肠埃希菌具有很好的抑菌效果。冯亚净等[14]报道了五味子中的木脂素对大肠埃希菌的抑菌效果。胡立磊等[15]研究表明，金银花提取物对大肠埃希菌具有很好的抑菌作用。徐倩倩等[16]报道了白头翁汤方剂及其单味药水提取液对猪、鸡大肠埃希菌具有很好抑菌效果。

本研究采用平板打孔法和改良微量二倍稀释法测定26味单味中草药对狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的体外抑菌活性，结果显示，五味子、诃子对狐源致病性大肠埃希菌呈极度敏感，抑菌圈直径在21.3 mm～20.3 mm之间，MBC均为7.825 mg/mL；金银花、黄连、苦参3种药物高度敏感，抑菌圈直径在16.4 mm～19.3 mm之间，MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL；对板蓝根、黄芩、五倍子等10种药物中度敏感；张慧等[17]报道了金银花、黄连对禽类大肠埃希菌抑菌效果最好。向双云等[18]报道鱼腥草、艾叶、五味子对大肠埃希菌K88高度敏感，与本试验结果存在一定的差异性，其原因可能与中草药制备工艺、所分离菌株的地区不同，感染的宿主动物等有关。由于中草药成分复杂，需要进一步研究中草药对致病性E.coli作用机理。本试验通过测定26味单味中草药对狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的体外抑菌活性，国内尚未见报道。本研究进一步研发防治狐狸大肠杆菌病复方中草药制剂及临床应用提供理论基础。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].6版.北京:中国农业出版社,2015.

[2] 张召兴,李蕴玉,张艳英,等.秦皇岛地区貉源E.coli的分离鉴定与耐药性分析[J].黑龙江畜牧兽医,2016(6下)：121-122.

[3] 马泽芳,崔 凯,高志光.毛皮动物饲养与疾病防制[M].北京:金盾出版社,2013.

[4] 毛福超,郁 川,韩 璐,等.豫西地区禽源大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析[J].河南农业科学,2016,45(1):127-130.

[5] 教郁,高维凡,胡彩光.大肠杆菌耐药性研究进展[J].现代畜牧兽医,2013(5):53-58．

[6] Stannarius C，Burgi E，Regula G，et al.Antimicrobial resistance inEscherichiacolistrains isolated from Swiss weaned pigs and sows[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2009,151(3):119-125．

[7] 张召兴,李蕴玉,常超越,等.中药对鸡致病性大肠埃希菌的体外抑菌试验[J].动物医学进展,2017,38(3):63-67.

[8] 张赛奇,王 米,蕾 娜,等.中药对猪源大肠杆菌O8体外抑菌试验研究[J].家畜生态学报,2015,36(8):62-65.

[9] 李蕴玉,张召兴,贾 青,等.单味中草药对鸡致病性绿脓杆菌体外抑菌试验[J].中国兽医杂志,2017,53(2):52-54.

[10] Haenni M,Chate P,Metayer V,et al.Comparative prevalence and characterization of ESBL producing Enterobacteriaceae in dominant verus subdominant enteric flora in veal calves at slaughterhouse,Francn[J].Vet Microbiol,2014,171(3-4):321-327.

[11] 夏利宁,高 娟,苏战强,等.新疆克拉玛依莫猪场不同生长期猪源大肠杆菌耐药性调查[J].家畜生态学报,2015,36(9):69-72.

[12] 程 锐,邹佳妤,李子佳,等.中兽医药防治鸡大肠杆菌病应用[J].中兽医医药杂志,2014(6):75-76.

[13] 靳双星,张桂枝.复方中药合剂对AA 肉仔鸡脾脏和法氏囊结构及发育的影响[J].东北农业大学学报,2014,45(4):1-5.

[14] 冯亚净,张媛媛,王瑞鑫,等.五味子木脂素对大肠杆菌的抑菌机理及效果[J].食品发酵业,2016,42(2):72-76.

[15] 胡立磊,郭永刚,樊克锋.金银花提取物对大肠杆菌体外抑菌试验[J].中兽医学杂志,2016(5):22-23.

[16] 徐倩倩，郭时金,王艳萍,等.白头翁汤方及其单味药水提取液对猪、鸡大肠杆菌体外抑菌活性的测定[J].黑龙江畜牧兽医,2016(6):185-187,191.

[17] 张 慧,秦志华,邹 明,等.抗禽大肠杆菌中药的体外抑菌方法和效果的研究[J].浙江农业学报,2014,26(3):598-602．

[18] 向双云,周珍辉,李玉冰,等. 8种中草药对大肠杆菌的体外抑菌试验[J].黑龙江畜牧兽医,2016(5下):167-169.