布鲁菌病实验室诊断技术研究进展

顾 盼，吴胜昔，刘学燕，曾 政，梁望旺，姚 璐

(1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 401120)

布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的世界范围内最广泛传播的人畜共患病之一，10个～100个布鲁菌就可能以空气传播的形式感染人[1-2]，可引起急性发热及潜在的慢性感染，病死率低但发病率极高，严重威胁人类健康[3-4]。羊布鲁菌(B.melitensis)、牛布鲁菌(B.abortus)、猪布鲁(B.suis)和犬布鲁菌(B.canis)是流行在多种家畜、野生哺乳动物及人类的主要布鲁菌[5]。

不同种属布鲁菌的毒性、传播方式及宿主特异性等均存在较大差异。布鲁菌可随患病动物及其产品如牛奶传播给人，而这类产品成分往往十分复杂。因此，精准及快速地检测布鲁菌一直是国内外科学家研究的热点，更是布鲁菌病防控检测及反生物战防护环节中重要的一环[6-7]。我国现有的布鲁菌病实验室诊断技术标准(GB/T 18646—2002)包括虎红平板试验(rose bengal test,RBT)、试管凝集试验(serum agglutination test,SAT)和补体结合试验(complement fixation test,CFT)等方法都有一定的缺陷，比如存在人为判断检测结果的主观性问题。虎红平板凝集试验因其敏感性较低、特异性不高而容易漏检或误检，不能区分免疫抗体和感染抗体，因此只适用于布鲁菌病的初筛。试管凝集试验有较高的特异性，但其敏感性依然低，且操作复杂、耗时长，整个检测过程需要2 d，不适合大批量检测。补体结合试验敏感性和特异性都不稳定，且试剂昂贵，因此其应用受到极大限制。随着分子生物学及免疫学技术的快速发展，越来越多的新型技术不断涌现，并逐步应用到布鲁菌病的诊断中。本文对这些新型实验室诊断方法的研究进展做一简要的综述。

1 病原学诊断

1.1 基于聚合酶链反应的检测

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)具有简便快速、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于传染病的诊断领域。现阶段有多种引物应用于布鲁菌病的诊断，PCR效果也因引物、选用的PCR方法以及样本的不同而存在差异(表1)。BCSP31(B4/B5)多应用于人布鲁菌病的诊断，检测人的血液样本时随着反应循环数的增加可进一步提高其灵敏度，不同的引物对特异性影响显著。Addour等比较了3对编码BCSP 31、牛布鲁菌的16 S rRNA以及编码Omp2基因片段所对应的引物B4/B5、F4/R2以及JPF/JPR的灵敏度，分别为98%、88.4%和53.1%[8]。由于不可避免的基因错配可能造成假阳性或假阴性结果，因而多种单引物技术的联用可作为规模化诊断布鲁菌病的分子诊断方法[9]。PCR在诊断布鲁菌病上最大的优势是可精确到布鲁菌的属，其中AMOS PCR是世界动物卫生组织 (Office International des Epizooties,OIE)确定的比较成熟的可以鉴别布鲁菌主要流行中的病原检测方法[10]。

在基层布鲁菌病诊断中，PCR往往受限于需配备特定的PCR仪，结果的判定有时还需借助其他试验完成。而环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以其可短时间内完成、试验结果可凭肉眼直接观察，不需要特定的PCR仪器等显著优势而广泛应用于流行病学监控、环境污染监测、临床疾病诊断以及食品安全检查等方面[12-13]。Ohtsuki R等[14]首次报道将LAMP技术应用于布鲁菌的检测，设计针对编码BCSP31基因的特异性引物，仅在35 min内就成功扩增出10 fg的布鲁菌DNA，且与Queipo-Ortuno M I等[15]建立的荧光定量PCR相比较，灵敏度相近，特异性更高，耗时更短。国内Song L等[16]建立了针对B.abortus的Omp25 基因的LAMP布鲁菌检测方法，并应用于奶样及血样的检测，其最低检测限可达到3.81 CFU/mL。LAMP用于布鲁菌的检测，具有良好的特异性与灵敏度，对布鲁菌病的早期诊断有着重要的意义。血液样本单引物PCR试验效果比较的相关研究见表1[8,11]。

表1 血液样本单引物PCR试验效果比较

1.2 表面增强拉曼技术

传统的检测手段依赖于病原菌的分离培养，根据表型及基因型的特征进一步归类到经典的布鲁菌种属。然而，尤其是检测牛奶这一类复杂的混合物时，基因分型的结果通常与现有的分类法不符以及基因错配都会造成结果的误差。表面增强拉曼技术(surface-enhanced raman scattering technology,SERS)通过分析分子特定的指纹信息，具有极高的分析灵敏度，其检测的灵敏度可达单分子水平[17-18]。若将SERS进一步与荧光反应连用检测，可大大提高检测样本数量,实现多重检测。据报道[19]利用SERE-荧光双重检测结核抗原，其检测限可达0.051 1 pg/mL。Meisel S等[1]利用这项技术检测牛奶及培养基中经甲醛灭活后的的7株布鲁菌、2株大肠埃希菌、 4株苍白杆菌、 5株铜绿假单胞菌和2株耶尔森菌，2 h内即可得到精确结果，培养基和牛奶中的布鲁菌的识别精度分别达92%和94%，对布鲁菌的生物变种的检测精度也在90%以上。SERS不仅准确区分单品种及混合品种的布鲁菌，而且能有效识别布鲁菌的生物变种，是潜在的可用于布鲁菌病早期诊断的金标准。

2 血清学诊断

2.1 酶联免疫吸附试验

目前用于布鲁菌病诊断的酶联免疫吸附试验(ELISA)主要有间接ELISA(indirect ELISA,IELISA)和竞争ELISA(competitive ELISA,CELISA)。ELISA最大的问题就是抗原的选择[6，20]，世界动物卫生组织推荐O型多糖(O-polysaccharide,OPS)或光滑型布鲁菌菌体脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)为标准抗原。但是假阳性结果是目前基于OPS的诊断方法的一大难题，该法易与含有光滑型布鲁菌OPS相似结构的革兰阴性菌(如大肠埃希菌O157:H7等)发生交叉反应，且不能区分疫苗接种与自然感染。因此，筛选到可取代OPS或sLPS的可靠抗原一直是各国科学家研究的焦点，如菌体脂多糖(rough lipopolysaccharide,rLPS)、细胞浆蛋白及重组BP26蛋白等[21]。使用rLPS或细胞浆蛋白，可在一定程度上降低假阳性反应[22]。Xin T等[23]发现，布鲁菌感染的个体均会产生高水平的针对LPS蛋白的抗体，但只有在羊布鲁菌16M型和M28型感染的绵羊、羊布鲁菌M28和牛布鲁菌2308型感染的山羊体内检测到BP26抗体，因此基于BP26蛋白的IELISA检测方法宿主特异性较高，从而局限了其适用范围。此外，基于repA蛋白的布鲁菌IELISA可有效区分野毒感染及疫苗接种个体[24]，这在布鲁菌病防控中具有重要意义。

CELISA的关键因素在于建立特异性好、灵敏度高的单克隆抗体。CELISA相较于IELISA，可以避免交叉反应引起的假阳性，此外CELISA可用于多种属的布鲁菌的检测，因此CELISA用于布鲁菌的检测是研究的热点。Nielsen K等[25]在原有的CELISA的基础上进行改进，以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的重组A蛋白和G蛋白(PAG蛋白)取代HRP酶标抗-抗体，建立了第二代针对SLPS蛋白的CELISA。经验证该法的特异性与第一代CELISA及IELISA相近，灵敏度略有下降，但PAG蛋白的使用消除了抗抗体的批次差异，有利于推进CELISA试剂盒的标准化操作。

2.2 时间分辨免疫荧光技术

时间分辨免疫荧光技术(time resolved fluorescent resonance energy transfer， TR-FRET)通过给相应的供体(或受体)标记上一长寿命荧光基团，通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到零，有效避免了假阳性反应。McGiven J A等[26]首次将TR-FRET应用于对布鲁菌抗体的检测，对相应cELISA试剂盒进行改造，给sLPS标准抗原标记上异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)基团，通过检测带长寿命的荧光基团抗布鲁菌BM40蛋白单克隆抗体以及阴阳性血清以优化反应条件，建立布鲁菌的TR-FRET检测方法。将其用于检测32份牛血清和41份羊血清，仅孵育30 min,且不需要任何洗涤步骤，结果与IELISA检测结果一致，具有100%诊断特异性和敏感性。国内郑腾等[27]以布鲁菌的BP26蛋白作为抗原包被成为检测线，以稀土荧光纳米颗粒标记的金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein A,SPA)作为检测物，检测715份牛血清，与RBT试验结果相比，符合率达92%，且与其他血清无交叉反应。此外，TR-FRET技术快速定量且重复性好，省去了ELISA反复洗涤和加样的步骤，并可同时检测低质量血清中的抗体和抗原，灵活使用。

2.3 荧光偏振试验

荧光偏振试验(fluorescence polarization assay,FPA)是OIE认为敏感性、特异性与ELISA相当的试验，美国于2004年将FPA确定为布鲁菌病诊断的官方确证试验。FPA对样本要求不高，不仅可用于血清检测，也可用于奶样的检测。Nielsen K等[28]对FPA测定感染布鲁菌的猪血清做出评价， FPA的敏感性及特异性分别是93.5%和97.2%，与IELISA(94.0%和97.9%)、CELISA(90.8%和96.6%)的结果相当。此外，通过双盲试验证实，FPA还可区分牛布鲁菌感染和疫苗S19免疫接种[29]。

2.4 横向流动免疫检测技术

横向流动免疫检测技术(lateral flow assay,LFA)首先应用于人布鲁菌病的诊断，随后用于动物布鲁菌病的诊断[30-32]。它是由加样垫和吸收垫构成的多孔硝基检测试纸条。Abdoel T等[32]利用牛布鲁菌1119-3株的LPS蛋白作为抗原来捕获血清中的抗体，使用40 nm胶体金颗粒标记的相应动物的IgG为检测物，分别检测牛、山羊、绵羊和猪的血清样本中的布鲁菌，结果显示，该法与病原菌分离这一金标准的符合率分别达90%、100%、77%和73%，与RBT及CFT结果均无明显差异，提示其有较高的特异性，但存在假阴性结果。LFA是一种成本低的快速检测方法，对操作技术要求低，无需配套设备，但敏感性低，适用于资源匮乏地区推广进行初步检测排查[33]。

2.5 其他技术

布鲁菌的检测样本数往往非常大，这一特点就要求了检测方法须具有高通量且有效的特点，如AlphaLISA技术，Luminex技术等。

2008年，AlphaLISA技术首次报道用于布鲁菌病诊断[34]。偶联抗布鲁菌的BM40单克隆抗体受体微珠与结合了羊布鲁菌16M菌株的sLPS抗原供体微珠结合于615 nm处出现特异性吸收峰，检测感染及未感染的布鲁菌的牛羊血清，敏感性及特异性分别达96%及98%以上，但存在一定的假阳性反应。AlphaLISA技术具有上样体积少(50 μL)，可在96/384/1536/3456孔板中操作，可作为布鲁菌高通量检测的选择方法，适用于布鲁菌病防控监测。

Luminex技术被誉为“真正的临床应用型生物芯片”，基于xMAP技术原理，将荧光编码微球、激光检测、应用流体学和计算机运算法则等多项技术进行整合，真正实现了“高通量”检测。Silbereisen A等[35]以多种方式灭活的布鲁菌免疫接种小鼠，成功构建出分别针对羊布鲁菌(B.Melitensis)和牛布鲁菌(B.abortus)的脂多糖的O抗原的单克隆抗体，进而建立了基于磁珠的Luminex xMAP检测方法。相较于ELISA，该法灵敏度显著提高，能够检测到10个～4 000个细胞(样品体积为50 μL)。此外，该方法可以同时检测一系列的相关样本，能够特异性识别混合样品如牛奶的布鲁菌病原菌。Luminex检测方法作为布鲁菌的检测方法是有前景的，高通量且高于ELISA的灵敏度，适用于布鲁菌病临床早期诊断。

3 小结

对于布鲁菌病诊断技术，不同的研究报道结果不尽相同。这通常与所选定的样本、样本数量、使用技术等多种因素有关。我国现行国家标准[36]中如补体结合试验和虎红平板凝集试验因其耗材便宜、无需配套设备等优点在疾控及研究机构广泛使用，但均存在操作复杂，结果受主观判断影响等缺点；而酶联免疫吸附试验等检测技术存在成本的问题。总体说来，目前布鲁菌病诊断方法的研究趋势总体围绕四个方面：削减成本，提高特异性，提高试验方法的实用性，以及提高区分感染动物和疫苗接种动物的可靠性。

布鲁菌分布范围广，可通过接触患病动物或食用患病动物产品传染给人，给动物和人造成了严重的健康威胁。实验室诊断是其中重要的一环，现有的诊断方法都有其相应的适用范围的优缺点。总而言之，病原检测方法的敏感性均高于血清学诊断方法；而血清学诊断方法中，敏感性以IELISA、FPA为高，特异性以LFA、CELISA、IELISA为高，而AlphaLISA技术及Luminex技术具有高通量的显著优势，成本则以FPA和TR-FRET占优势。因此，多种诊断方法如敏感性高的初筛方法与特异性高的复筛方法联合使用，是现阶段布鲁菌病诊断的主要方法。

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