牛无形体病研究进展

戴熙廷，宝 玲，麻明彪，白若兰，彭 芸，陶律延，赵 华，沈龙强，宝福凯，柳爱华

(昆明医科大学/昆明医科大学云南省高校热带传染病重点实验室，云南昆明 650500)

蜱虫是一种吸食血液的体表寄生虫，是多种人兽共患病的主要传播媒介。其中，无形体病就是一种经蜱虫叮咬传染引起的自然疫源性疾病。据报道，牛无形体病主要由边缘无形体(Anaplasmamarginale)、中央无形体(Anaplasmacentrale)、牛无形体(Anaplasmabovis)和嗜吞噬细胞无形体(Anaplasmaphagocytophilum)感染所致。其中，暴发性感染多见于边缘无形体；中央无形体感染则少有暴发性感染，多引起中度贫血；嗜吞噬细胞无形体感染多见于啮齿动物，也可感染人体，其感染人体引发的疾病称为人粒细胞无形体病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)[1]。21世纪之前，无形体属与埃利希体属的分类并不明确。2001年经修订后，嗜吞噬细胞无形体(原嗜吞噬细胞埃利希体)、牛无形体(原牛埃利希体)、片状无形体(原片状埃利希体)都被囊括到了无形体属中[2]。牛无形体在伊朗璃眼蜱的传染试验中被首次报道，这是人们认识并探究牛无形体的开端。

1 病原学特性

牛无形体，原名牛埃利希体[2]，属于立克次体目、埃利希体科、无形体属，是一种革兰染色阴性专性胞内寄生菌。该病原体寄生在动物的单核细胞中，大小1 μm～6 μm不等，经单核细胞吞噬后呈碎片状聚集[3]。Prasath N B等[4]用1只杂交泽西岛白牛的外周血进行雷氏曼-姬姆萨涂片染色，观察到了单核细胞胞浆中存在多种包涵体形态,其中最常见的是小型(约0.5 μm～1 μm)和中型(约2 μm～3 μm)球状体，而3 μm～6 μm的成熟包涵体最少见。镜下偶见紧密聚集的成熟包涵体，呈桑椹胚状。若单个单核细胞胞桨中出现多重桑椹体，这表明机体免疫系统受损；若胞桨中出现清晰可见的空泡并带有淡粉色边缘，则表明通过感染进入体内的病菌体正处于溶解和边集状态。

2 流行病学

2.1 传染源

早在2006年，Kawahara M等[5]已从日本大陆与北海道地区的硬蜱和梅花鹿体内分离检测出了牛无形体和嗜吞噬细胞无形体的基因片段。2008年，Ohshiro M等[6]在日本冲绳县与那国岛的牛体中检测到了牛无形体和嗜吞噬细胞无形体的DNA片段，首次证实在亚洲地区牛无形体病原体具有感染牛的能力。在美国、巴西、西班牙、土耳其、印度、泰国、韩国、日本以及我国中南部及台湾等地[5-13]均有关于牛无形体的报道。Pazhoom F等[14]从伊朗当地的缺角血蜱(Haemaphysalisinermis)唾液DNA中检测到牛无形体的基因片段，发现缺角血蜱中存在牛无形体，这在全球范围内尚属首次。储存宿主是病原体传播的重要源头之一，也是科学研究的始发点。据多项研究报道，已确定鹿、牛、水牛、象鼩、山羊等反刍动物作为天然储存宿主，携带并传播查菲埃立克体(Ehrlichiachaffeensis)和牛无形体两种病原体[5-6,12,15-18]；非反刍动物中除了日本野生浣熊[19]外，狗体内也发现了牛无形体DNA的存在[20]。目前的报道中尚未出现牛无形体感染人的病例，在研究该病原体过程中，危及研究者的实验室传播几乎不会发生。尽管如此，我们仍建议研究牛无形体的实验室生物安全等级应达到生物安全一级(biosafety level 1，BSL1)及以上。

2.2 传播途径

据目前所知，不同国家的研究员们在多种蜱虫体内发现了牛无形体存在，其中包括缺角血蜱(Haemaphysalisinermis)、具尾扇头蜱(Rhipicephalusappendiculatus)、彩饰花蜱(Amblyommavariegatum)和截形璃眼蜱虫(Hyalommatruncatum)[21-22]。蜱虫叮咬易感群体后，病原体随血液播散到被叮咬者全身各处，从而引发相应临床症状。

2.3 易感群体

牛、羊等反刍动物是牛无形体的主要宿主。不同动物体的易感程度有所不同，其差异受到多方因素影响作用。另外，Said M B等[23]发现亚湿润地区动物的无形体患病率高于湿润区的动物，这一差异通常见于血液寄生虫，可能与带菌蜱虫分布于不同气候带有关[24]。除了上述的差异，绵羊和山羊的感染率也有着显著统计学差异，主要影响因素有蜱虫监控程序、农场管理系统、畜牧方法的不同，野生储存宿主的多样性，以及一些非生物因素等[8]。在亚洲大陆，已有研究证实鹿群不仅携带病原体嗜吞噬细胞无形体，还是牛无形体的储存宿主。在野生鹿中还发现了中央无形体，嗜吞噬细胞无形体，牛无形体3种病原体的复合感染。Kawahara M等[5]对33只感染鹿的血清进行检测，其中14只鹿(42%)存在埃利希体和无形体混合感染(8只联合感染两种病原体，6只联合感染3种病原体)。此外，在我国中南部地区[8]，对262只山羊的血标本进行检测后发现，羊无形体和牛无形体混合感染在所有交叉感染类型中所占比例最高(27.1%)。这在一定程度上表明生物群缺乏对多种无形体交叉感染的免疫抵抗能力，无形中增加了血涂片和血清学诊断的难度[6]。尽管我们现在对牛无形体有了基本的了解，但是相关致病机制仍不明确，需要进一步的深入研究。

3 临床表现

通常情况下，牛感染牛无形体后鲜少有临床表征。但在部分病例中，经病原体感染后会表现出高热、乏力、消瘦、腹泻、贫血、淋巴结肿大、抑郁、嗜睡、抽搐，甚至流产和死亡等一系列症状[17,23]。同时，对嗜吞噬细胞无形体和牛无形体交叉感染的血液进行生化检测，发现血清中尿素氮、总胆固醇、钾钙离子浓度以及白蛋白/球蛋白比值均降低[25]，这或许与病体营养不良有关。另有研究称嗜吞噬细胞无形体感染者表现出白细胞减少症和血小板减少症，同样，经牛无形体感染的动物也出现了上述症状[26-27]。

4 诊断方法

4.1 外周血涂片和血清学检测

牛无形体是专性胞内寄生菌，感染了无形体的动物通常会成为永久携带者。当患病动物处于感染急性期时，人们往往考虑对患病牛外周血进行涂片检测，以诊断病原[22]。涂片检查作为病原微生物鉴别诊断的常用手段，具有适用范围广和简便直观的优点。因此，在实验室检查中，仍将涂片检测列为常规项目之一。

经过对比试验，Walker D H等[26]发现，血涂片检查立克次体时，吖啶橙染色(Acridine orange staining)较姬姆萨染色(Giemsa staining)具有同样或更高的敏感性。需要注意的是，如果从活体中抽取血液，应尽量采集颈静脉或者其他大血管中的血液；如果是尸检，可以制作内脏器官(包括肝、肾、心脏和肺)的组织涂片或者抽取外周血管血液制作血涂片。加入了抗凝剂的血液标本应在4℃保存运输[7]。

然而，牛无形体与牛巴贝斯原虫(Babesiabovis)不同(表1)，除少数处于疾病复发期的病例，一般很难从动物急性感染期的血清中检测到无形体。为了克服涂片检测敏感性较低这一缺陷，研究人员采取了多种血清学方法来监测持续感染的动物群[1]，例如，直接镜检和PCR是临床病例的诊断的推荐方法，ELISA则是流行病学监测和动物接种疫苗后免疫状况检测的推荐方法。

检测带菌宿主时，竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)有良好的敏感性。检测多种无形体病原体交叉感染时，C-ELISA在同类试验中的特异性明显更高[1]。嗜吞噬细胞无形体的P44基因编码主要膜蛋白P44，这种蛋白在嗜吞噬细胞无形体中特异表达。在来自美国和英国的不同嗜吞噬细胞无形体菌株中都发现了p44的同源基因。据Tajima T等[28]报道，利用rP44(p44重组蛋白的一种)非融合蛋白作为抗原进行ELISA检测的方法具有简便、快速、特异性高的优点，但这种检测方法还未在牛无形体感染病例中有所应用，这是因为还未在病原体牛无形体中发现具有高度特异性的抗原簇。当诊断牛无形体病时，除去患病动物在感染早期(<14 d)，或已经接受治疗这两种情况，C-ELISA和卡片凝集试验(card agglutination test,CAT)仍是大多数实验室首选的检测方法[1]。

表1 牛无形体与巴贝斯原虫鉴别要点

注：CAT.卡片凝集试验；CFT.补体结合试验；ELISA.酶联免疫吸附试验；IFAT.间接荧光抗体试验；PCR.聚合酶链反应。

Note：CAT.Card agglutination test；CFT.Complement fixation test；ELISA.Enzyme-linked immunosorbent assay；IFAT.Indirect fluorescent antibody test;PCR.Polymerase chain reaction.

4.2 PCR检测

血清学检测发展至今已经成为了实验室检查最常用的手段之一，但是因其特异度与灵敏度的缺陷，仍不能成为100%可信的诊断依据。为了提高病原体的检出率，以DNA分子技术为基础发展起来的具有更高灵敏性和特异性的检测方式逐渐受到重视[22]，如套式PCR(nested PCR)、实时定量PCR(real-time PCR)等。

科学技术迅猛发展的今天，若想对患病动物所感染的病原体进行鉴定，通常会联合使用PCR及DNA测序的方式来达到目的。在使用PCR检测无形体的过程中，往往需要经过两次扩增。第一次扩增，使用引物EE1和EE2(或EC9和EC12A)[6,29]扩增无形体种属的16 S rRNA基因，并对其产物进行测序[6]。但是，由于16 S rRNA具有高度保守的特性，这一特性使得它并不能反映无形体菌株和种之间的亲缘关系[17]。因此，还要进行第二次扩增，使用不同无形体菌株相对应的特异引物进行扩增。接着对第二次扩增之后的产物进行测序，根据测序结果，通过Blast(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)进行序列比对。早在2012年，Liu Z等[8]收集了来自中国南部的261份山羊血液标本，并对其分别进行病原体牛无形体、羊无形体和嗜吞噬细胞无形体基因检测。研究发现，牛无形体经其特异性引物AB1f和AB1r扩增后在551 bp处有其特异片段出现[5]。牛无形体特异性核酸检测的应用，使得牛无形体病与其他蜱虫传播疾病的鉴别更加容易，也更加精确。

4.3 LAMP检测

自2000年Nimitphak T发表了LAMP(环介导等温扩增)技术以来，该技术被广泛应用于多种病原体的研究中。Wang J等[30]设计了4对LAMP引物，对来自绵羊和山羊的200份血液标分别使用传统PCR、套式PCR和LAMP检测牛无形体是否存在。结果显示，上述3种检测方法的阳性率分别为18.3%、35.8%和67.5%，检测过程中未出现与其他4种病原体(嗜吞噬细胞无形体、吕氏泰勒虫、莫氏巴贝斯虫和日本血吸虫)的交叉反应。并且，LAMP的灵敏度为5×100copies/μL，是传统PCR灵敏度(5×102copies/μL)的100倍。由此可见，LAMP具有着较高的特异性和灵敏性，与前两种方法相比，有着快速经济、便捷高效的优点，经过不断的验证和完善，该技术有望成为新兴的牛无形体检测方法。

5 预防和治疗

牛无形体病不仅危害着不同的易感群体，还给疫源地造成了严重的经济损失,影响主要体现在牛及其他易感动物的生长发育减缓，奶肉产量降低，流产，死亡和治疗费用[31]。由于上述原因，部分学者认为应将疫苗用于控制牛无形体的传播，并称此种方法经济而有效。在一些国家，人们给牛群接种边缘无形体减毒活疫苗以抵抗相应病原体的感染。然而不幸的是，接种该疫苗后动物会产生一系列不良反应。目前，针对无形体病的活疫苗主要有两种，分别是减毒边缘无形体菌株疫苗和低致病力的中央无形体菌株疫苗。尚未见有与牛无形体疫苗相关的报道。

动物感染后，在进行一般支持疗法的同时，最主要的是及时使用四环素类药物抑制病原的蔓延。出现大面积暴发疫情时，应大范围杀灭蜱、鼠，并清理环境，降低环境中疑似传播源的密度。对患病动物的血液、分泌物及排泄物等污染物进行彻底消毒处理，尽可能地阻断一切传播途径。

6 展望

牛无形体病是一种蜱传播的全球性动物源性疾病。动物感染牛无形体后，部分患病动物会表现出贫血、黄疸，甚至流产和死亡等一系列临床症状。由于牛患该病后很少出现临床症状，临床上主要通过血清学检测方法来确诊牛无形体病。为了提高诊断方法的灵敏度和特异度，分子水平的诊断技术有PCR和LAMP。目前，对牛无形病及其病原体的研究已经进入基因检测水平，但是相关致病机理仍不清楚。随着对牛无形体病的深入研究，在进一步明确其致病机制的基础上，期望不仅能够研发出更快、更精确的诊断技术，也能研发出更加安全、有效的防治药物。

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