PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法的建立及初步应用

蒲翠敏，冯旭芳，张双翔，胡兴义，张 海，丁尊俄，王开功*，周碧君，文 明，程振涛

(1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州省德江县动物疫病预防控制中心，贵州德江 565200；3.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳 550001)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由冠状病毒科冠状病毒属的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起仔猪和育肥猪以呕吐、腹泻、脱水为特征的一种急性、接触性肠道传染病。 PED于1971首次发现于英国，其病原体PEDV于1977年首次在比利时发生急性腹泻的猪群中分离到，并命名为CV777株[1]。我国于1973年首次发现该病[2]。2010年10月以来，仔猪急性感染性腹泻广泛流行，发病率、病死率高，给养猪业造成了严重的经济损失[3-4]。猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起猪的一种高度接触性肠道传染病，以2周龄以内仔猪呕吐、严重腹泻、失水和高病死率为主要特征，属于世界动物卫生组织(OIE)规定必须上报的猪传染病[5]。我国从20世纪50年代末就有该病的报道，近几年来在我国仍时有发生和流行，给养猪业造成了极大的损失[6]。猪轮状病毒病是一种人畜共患病，是由猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PoRV)引起1日龄～5日龄或断奶仔猪的一种以厌食、呕吐、腹泻和脱水，以及机体酸碱平衡紊乱、死亡为特征的接触性传染病。1982年，我国学者从腹泻猪粪便中分离到PoRV，证实了PoRV在我国各规模化养猪场普遍存在[7]。由于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒引起的猪病毒性腹泻，在临床症状与病理变化上很难鉴别区分，必需通过实验室方法确诊，所以需要建立一种能够同时检测这3种病毒且敏感、特异的方法，能够快速且大批量的对临床样本进行检测。目前，国内外针对PEDV、TGEV和PoRV已有单项和多重RT-PCR[8-10]、单项和多重荧光定量PCR[11-13]等病原学快速检测方法的报道。本研究结合当前国内外流行毒株的遗传变异新特点，针对3种病毒基因的保守区域，设计特异性引物，建立了能同时检测并区分PEDV、TGEV和PoRV的三重PCR检测方法，对临床快速鉴别检测及流行病学调查具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验毒株 PEDV-TGEV-PoRV三联疫苗(含猪传染性胃肠炎病毒弱毒株、猪流行性腹泻病毒CV777弱毒株和猪轮状病毒NX株，山东沈氏动保集团，批号：201605)，贵州省瑞特农牧发展有限公司产品；猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病2型(PCV2)阳性样本，北京世纪元亨动物防疫有限公司产品。

1.1.2 主要试剂 RNA及DNA提取试剂盒，北京世纪元亨动物防疫有限公司产品；PrimeScriptTMRT Master Mix，TaKaRa公司产品；PCR扩增试剂及分子克隆试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品；E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit 胶回收试剂盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Kit质粒提取试剂盒，Omega公司产品；Bst DNA聚合酶，NEG生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 分别根据PEDV S基因、TGEV M基因及PoRV VP7基因保守序列各设计一对特异性引物(PEDV-P1/PEDV-P2、TGEV-P1/TGEV-P2及PoRV-P1/PoRV-P2)，并送上海英俊生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 多重PT-PCR特异性引物

1.2.2 质粒标准品的制备 取PEDV-TGEV-PoRV三联疫苗株毒液，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，利用一步RT-PCR法扩增目的基因，将RT-PCR产物纯化回收连接pMD19-T载体，转化，构建pMD19-T-PEDVS、pMD19-T-TGEVM、pMD19-T-PoRVVP7共3种重组质粒，并通过PCR测序鉴定。

1.2.3 PEDV、TGEV和PoRV单项PCR反应条件优化 以已构建的3种重组质粒为模板，取2×TaqDNA master mix 12.5 μL，Primer 1(10 μmol/L) 0.5 μL，Primer 2(10 μmol/L)0.5 μL，模板2.0 μL，ddH2O补至25 μL，建立25 μL反应体系,进行PCR扩增。设置退火温度梯度(51、53、55、57、59℃)、引物浓度梯度(0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L)进行PCR扩增，确定最佳退火温度、引物浓度，优化反应条件。

1.2.4 PEDV与TGEV双重PCR反应条件优化 根据PEDV及TGEV单项PCR条件优化结果，建立25 μL PEDV及TGEV双重PCR反应体系，体系为：2×TaqDNA master mix 12.5 μL，PEDV Primer Mix(10 μmol/L) 2.0 μL，TGEV Primer Mix(10 μmol/L) 1.5 μL，质粒模板各1.0 μL，ddH2O补至25 μL。对退火温度(51、53、55、57、59℃)、pMD19-T-PEDVS/pMD19-T-TGEVM模板比例(1 μL/1 μL、1 μL/1.5 μL、1.5 μL/1 μL、2 μL/1 μL、1 μL/2 μL)、PEDV/TGEV引物浓度(0.2 μmol/L∶0.6 μmol/L、0.3 μmol/L∶0.5 μmol/L、0.4 μmol/L∶0.4 μmol/L、0.5 μmol/L∶0.3 μmol/L、0.6 μmol/L∶0.2 μmol/L、0.7 μmol/L∶0.2 μmol/L )设定梯度，优化PCR扩增条件。

1.2.5 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR反应条件优化 根据PEDV、TGEV和PoRV单项PCR条件优化结果，建立PEDV、TGEV和PoRV三重PCR反应体系：2×TaqDNA master mix 12.5 μL，PEDV Primer Mix(10 μmol/L) 2.0 μL，TGEV Primer Mix(10 μmol/L) 1.5 μL，PoRV Primer Mix(10 μmol/L) 2.0 μL，质粒模板各1.0 μL，ddH2O补至25 μL。将退火温度设置5个梯度(51、53、55、57、59℃)优化退火温度，在最佳退火温度及PEDV与TGEV双重PCR已优化条件的情况下，设定5个pMD19-T-PoRVVP7添加量梯度(0.5、0.75、1、1.25、1.5 μL)，PoRV引物浓度梯度(0.15、0.2、0.25、0.3 μmol/L)进行三重PCR扩增反应条件优化。

1.2.6 三重PCR特异性及敏感性试验 利用已经建立并优化好的三重PCR对单一模板、三联模板、PCV2、CSFV、PRRSV进行检测，评价其特异性。将3种重组质粒的拷贝数调整为1×1010拷贝/μL，进行10倍倍比稀释，分别以1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL稀释液为模板进行三重PCR扩增反应，评价其敏感性。

1.2.7 三重PCR临床应用 利用已建立的PEDV、TGEV和PoRV三重PCR对102份临床病料进行检测，并与单项PCR检测结果对比分析。

2 结果

2.1 单项PCR条件优化

以pMD19-T-PEDVS、pMD19-T-TGEVM、pMD19-T-PoRVVP7三种重组质粒为模板，对退火温度及引物浓度进行优化。结果显示，PEDV在5个不同温度下均能扩增出条带，TGEV在55℃时条带最为清晰，PoRV在51℃及53℃条带较清晰(图1)；PEDV、TGEV和PoRV的引物浓度分别为0.5、0.4、0.4 μmol/L时，条带清晰，且无非特异性扩增(图2)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.51、53、55、57、59℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.51,53,55,57,59℃

图1 PEDV、TGEV和PoRV单项PCR退火温度优化

Fig.1 The amplification of single PCR under different anneal temperature for PEDV,TGEV and PoRV,respectively

M.DNA 标准DL 2 000;1～4.0.2、0.3、0.4、0.5 μmol/L

M.DNA Marker DL 2 000;1～4.0.2,0.3,0.4,0.5 μmol/L

图2 PEDV、TGEV和PoRV单项PCR引物浓度优化

Fig.2 The optimization of primer concentrations of single PCR for PEDV,TGEV and PoRV,respectively

2.2 PEDV与TGEV双重PCR条件优化

建立25 μL双重PCR反应体系，在单项PCR优化条件的基础上，对退火温度、模板比例和引物浓度进行优化。结果表明，最佳退火温度为51℃、TGEV和PoRV的最佳模板量分别为2 μL和1 μL、PEDV与TGEV的最佳引物浓度为0.5 μmol/L∶0.3 μmol/L(图3～图5)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.51、53、55、57、59℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.51,53,55,57,59℃

图3双重PCR退火温度优化

Fig.3 The amplification of duplex PCR under different anneal temperatures

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.1∶1、1∶1.5、1.5∶1、2∶1、1∶2

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.1∶1,1∶1.5,1.5∶1,2∶1,1∶2

图4双重PCR反应模板比例的确定

Fig.4 The determination of template proportions for duplex PCR

M.DNA 标准DL 2 000;1～6.0.2∶0.6、0.3∶0.5、0.4∶0.4、0.5∶0.3、0.6∶0.2、0.7∶0.2

M.DNA Marker DL 2 000;1-6.0.2∶0.6,0.3∶0.5,0.4∶0.4,0.5∶0.3,0.6∶0.2,0.7∶0.2

图5不同引物浓度下的双重PCR反应

Fig.5 The results of duplex PCR under different primer concentrations

2.3 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR的条件优化

根据优化好的双重PCR条件，对三重PCR的退火温度、PoRV模板量、PoRV引物浓度优化。结果在退火温度51℃、PoRV的模板量1.5 μL、PoRV引物浓度为0.3 μmol/L时PCR反应条件最佳(图6～图8)，所以最终确定三重PCR反应体系为：2×TaqDNA master mix 12.5 μL，PEDV Primer Mix(10 μmol/L) 2.5 μL，TGEV Primer Mix(10 μmol/L)1.5 μL，PoRV Primer Mix(10 μmol/L) 1.5 μL，PEDV模板2 μL，TGEV模板1 μL，PoRV模板1.5 μL，ddH2O补至25 μL。PCR循环参数为：95℃ 3 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 45 s，循环35次；最后72℃ 10 min。

2.4 三重PCR特异性分析

利用已经建好的三重PCR方法对单项模板、三联模板、PCV2、CSFV、PRRSV进行检测。结果显示，PEDV、TGEV和PoRV单项和混合模板的三重PCR检测呈阳性，而PCV2、CSFV及PRRSV的三重PCR呈阴性(图9)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.51、53、55、57、59℃

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.51,53,55,57,59℃

图6三重PCR退火温度优化

Fig.6 The amplification of triplex PCR under different anneal temperatures

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.pMD19-T-PoRVVP7分别为0.5、0.75、1、1.25、1.5 μL

M.DNA Marker DL 2 000;1-5.pMD19-T-PoRVVP7 amounts were 0.5,0.75,1,1.25,1.5 μL

图7三重PCR反应中PoRV模板量的确定

Fig.7 Determination of PoRV template dosages in triplex PCR

M.DNA 标准DL 2 000;1～4.PoRV引物浓度分别为0.15、0.2、0.25、0.3 μmol/L

M.DNA Marker DL 2 000;1-4.PoRV primer concentrations were 0.15,0.2,0.25,0.3 μmol/L

图8三重PCR引物浓度优化

Fig.8 The optimization of primer concentrations for triplex PCR

M.DNA 标准DL 2 000;1.PEDV/TGEV/ PoRV;2.PoRV;3.TGEV;4.PEDV;5.CSFV;6.PCV2;7.PRRSV

M.DNA Marker DL 2 000;1.PEDV/TGEV/ PoRV;2.PoRV;3.TGEV;4.PEDV;5.CSFV;6.PCV2;7.PRRSV

图9三重PCR特异性试验

Fig.9 The spicificity test of the triplex PCR

2.5 三重PCR敏感性分析

分别取1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL稀释液进行三重PCR扩增，根据模板的最低检测量评价其敏感性。结果显示，PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×102、1×100、1×103拷贝/μL(图10)。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.1×104、1×103、1×102、1×101、1×100拷贝/μL

M.DNA Marker DL 2 000;1～5.1×104,1×103,1×102,1×101,1×100copies/μL

图10三重PCR敏感性试验

Fig.10 The sensitivity test of the triplex PCR

2.6 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR临床应用

应用建立的三重PCR方法对102份临床病料进行PEDV、TGEV和PoRV检测，并与单项PCR结果进行对比分析，结果见表2。

表2 临床病料中PEDV、TGEV和PoRV检测结果

3 讨论

随着我国养猪行业规模的不断扩大，猪的病毒性腹泻给养猪业造成了严重的危害和巨大的经济损失。引起猪病毒性腹泻最主要的病原就是猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒这3种病毒，它们可以对各个年龄阶段的猪造成危害，但以仔猪最为严重，病死率高，即使猪耐过存活，康复猪也生长缓慢，致使饲料报酬降低[14]。这3种病毒感染引起的临床症状和病理变化非常相似，且常存在混合感染。杜季梅[15]对河南省58个不同规模猪场181份发病仔猪的病料进检测，PEDV与TGEV、PoRV混合感染率分别为2.76%、2.21%，3种病毒混合感染率为0.55%；毛黎红等[16]对贵州省9个规模化养猪场腹泻粪便样品进行检测，1个猪场存在PEDV与TGEV混合感染；2个猪场存在PEDV与PoRV混合感染，给猪病毒性腹泻的临床诊断带来了一定的困难。因此，建立一种能够同时检测这3种病毒且快速、敏感、特异的方法，对于猪病毒性腹泻的确诊及防控工作有着非常重要意义。

PCR作为分子生物学技术中最常用的检测技术，它能针对不同的组织样本进行检测，具有重复性好、特异性强、灵敏度高，检出时间短等特点。因此，PCR技术已成为病原鉴别诊断的首选方法。多重PCR是在单项PCR的基础上加以改进建立的，不仅能够同时扩增出多个目的基因，而且效率高、省时、节约成本。在多重PCR的建立过程中，合理的引物设计尤为重要，本研究使用的引物是分别针对PEDV S基因、TGEV M基因及PoRV VP7基因这些高度保守性的序列所设计的3对特异性的引物，且扩增目的片段大小有合适的梯度，便于电泳时观察区分。

本研究在对三重PCR的反应条件进行优化时，先对检测3种病毒的各自单项PCR的退火温度、引物浓度等条件进行优化，确定检测3种病毒单项PCR反应的公共条件；再根据单项PCR的公共反应条件对检测PEDV和TGEV的双重PCR反应条件进行优化；最后根据双重PCR反应条件对三重PCR反应条件进行优化，最终建立了三重PCR检测方法，并进行了特异性、敏感性试验。结果显示，所建立的3重PCR检测方法特异性高，与PCV2、CSFV、PRRSV无交叉反应；敏感性强，PEDV、TGEV和PoRV质粒模板的最低检测量分别为1×102copies/μL、1×100opies/μL、1×103copies/μL，与龙飞翔等[17]所建立的多重PCR检测方法进行比较，增加了单项PCR与双重PCR反应条件的优化，并对3种病毒的模板添加比例进行了优化，而与曹玉琴[18]所建立的方法比较，增加了病毒模板添加比例条件的优化，所以本研究PEDV、TGEV和PoRV最低检测量与龙飞翔PEDV、TGEV、PoRV 重组质粒最低检出量1.41×103copies/μL、1.41×102copies/μL、1.41×103copies/μL和曹玉琴的PEDV、TGEV、PoRV 阳性RNA模板最低检出量1.5×105copies/μL相比都低，灵敏度更高。同时，本研究所建立的3重PCR检测方法与PCV2、CSFV、PRRSV均无交叉反应，特异性高。对临床送检的102份病料进行PEDV、TGEV和PoRV检测，结果三重PCR与单项PCR的检出符合率为100%。总之，本研究所建立的PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法快速、特异、敏感，可应用于临床病原的检测与流行病学的调查研究。

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