传染性蛋白的“负面”和“正面”（5）

朱钦士 （美国南加州大学医学院）

（上接2018年第7 期第13 页）

2.15 载脂蛋白A-I 引起的淀粉样变性病 载脂蛋白（apolipoproteins）能结合脂性分子例如甘油三脂和胆固醇，形成脂蛋白（lipoproteins），在血液运输脂肪的过程中起重要作用。 载脂蛋白有多种，其中的载脂蛋白A-I（Apolipoprotein A-I，ApoA-I）是血浆中高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的主要蛋白成分（约占70%），在胆固醇的运输中起重要作用。

ApoA-I 由肝脏和肠道细胞合成，由243 个氨基酸残基组成。 在血液中，大约95%的ApoA-I 结合在高密度脂蛋白中，其分子构造的80%为α-螺旋，没有β-折叠。 其余的5%以不结合脂肪分子的形式存在，分子中也有大约60%的肽链部分在α-螺旋中，没有β-折叠。 这部分游离的ApoA-I 分子，特别是其中氨基端的100 个左右的肽链部分，易改变折叠情况。 基因突变也会改变ApoA-I 的折叠状况，形成β-折叠，像Prion 蛋白那样形成分子聚合物，在身体各处沉积，引起淀粉样变性病。

从患者身上的淀粉样沉积提取到的ApoA-I一般不是完整的蛋白分子，而只是氨基端的几十个氨基酸残基组成的肽链，长度从83～100 个氨基酸残基。有些片段并不含有氨基酸序列的变化，但也有许多含有个别氨基酸残基的变化。 根据有无氨基酸序列的变化和变化的具体情形，症状的差别也很大。有的是全身性的，有的仅限于某个器官（通常是肾脏）； 有的影响神经系统，有的与神经系统无关，说明沉积处和致病性与片段的性质有关。 ApoA-I 的例子在这方面很有代表性，因此在下面详细介绍。

第26 位的甘氨酸变为精氨酸（Gly26Arg）能引起全身性的淀粉样变性病，包括影响外周神经的多发性神经病变（polyneuropathy）。 从一位死于该病患者的肝脏和脾脏提取的淀粉样沉积物，发现其主要成分为ApoA-I 蛋白的氨基端部分（残基1～83），其中含有第26 位变化了的氨基酸，从甘氨酸变为精氨酸，肽链会增加一个正电荷。

第50 位的氨基酸残基从色氨酸变为精氨酸（Trp50Arg），肽链也会增加一个正电荷，但是这样的改变并不影响神经系统，而主要影响肾脏。从患者肾脏提取的淀粉样沉积物含有ApoA-I 的氨基端部分（残基1～86、1～92、1～93），自然也含有第50位变化了的氨基酸。患者肾病综合症日趋严重，最后不得不进行肾移植。

第60 位的亮氨酸残基变为精氨酸（Leu60Arg），肽链也增加一个正电荷。该变化不影响神经系统，对肾脏影响也不大，而主要影响肝脏和脾脏。在患者的肝脏和脾脏中都发现大量的ApoA-I 淀粉样沉积，其中的ApoA-I 也不是全长，而是氨基端部分（残基1～88、1～92、1～93、1～94），且都含有第60位的氨基酸变化。

第64 位的氨基酸残基从亮氨酸变为脯氨酸（Leu64Pro），不引起肽链电荷变化。 该突变只影响肾脏，其淀粉样沉积物中的ApoA-I 含有蛋白的氨基端部分（残基1～96）。

第75 位的氨基酸残基从亮氨酸变为脯氨酸（Leu75Pro）也不引起肽链的电荷变化。 该变化主要影响肝脏和肾脏。患者肝脏指标（碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶）持续升高。 一些患者发展至肾衰竭。

第90 位的亮氨酸变为脯氨酸 （Leu90Pro）会引起心肌和皮肤的淀粉样病变。患者在54 岁时死于心脏衰竭。生前心功能受损，稍活动即呼吸困难（excertional dyspnea）。 皮肤出现溃疡，从前额开始逐渐扩散至脸部、颈部、肩部和上臂。 心脏中的淀粉样沉积可用刚果红染色，其中蛋白为ApoA-I蛋白的氨基端（最长为残基1～94）。该肽链部分也含有第90 位的氨基酸残基改变，此改变不造成ApoA-I 蛋白的电荷变化。

在一些情况下，基因突变不限于单个核苷酸的变化，而是若干碱基的缺失。例如在英国发现一个家族的3 代人中都有人患肾病，有人因此死亡，也有人在做肾移植后存活。 检查受影响成员的DNA，发现患有肾病的成员在ApoA-I 基因中有9个碱基缺失，造成ApoA-I 蛋白中3 个氨基酸残基的缺失，即第70 位的谷氨酸、第71 位的苯丙氨酸和第72 位的色氨酸（Glu70Phe71Trp72del）。 此变化也使得ApoA-I 蛋白减少了一个负电荷。

另一种碱基缺失并伴有碱基插入的例子是在一个西班牙家族中发现的。受影响的成员通常在50多岁即死于肝脏衰竭。患者肾脏中的淀粉样沉积含有ApoA-I 蛋白的氨基端部分（残基1～83/92）。 检查患者的ApoA-I 基因，发现ApoA-I 蛋白中第60到第71 的12 个氨基酸残基缺失（Leu60Arg61－Glu62Gln63Leu64Gly65Pro66Val67Thr68Gln69Glu7－0Phe71del），同时又在缺失处添加了另外2 个氨基酸残基缬氨酸/苏氨酸。 此变化也减少一个负电荷。

以上所列举的氨基酸残基变化都发生在ApoA-I 蛋白氨基端的100 个残基内。 但在这100氨基端残基外的氨基酸残基变化，虽不包含在沉积物中的ApoA-I 氨基端肽链内，也能引起淀粉样变性病。

第172 位的谷氨酰胺变为脯氨酸（Gln172Pro）会引起心肌病变，而第173 位的精氨酸变为脯氨酸（Arg173Pro）除造成心肌病变外，也会造成皮肤病变。 从心肌提取的淀粉样沉积发现沉积物为ApoA-I 蛋白的氨基端部分（1～90/100）。 同样是在173 位上的氨基酸残基改变，但精氨酸不是变为脯氨酸，而是变为半胱氨酸（Arg173Cys），不但不引起疾病，反而会增加人的寿命。该变化是在意大利的Milano 地方发现的，称为Milano 型变异（apolipoprotein A-1 Milano）。

第174 位上的亮氨酸变为丝氨酸（Leu174Ser）会造成心肌病变。 从心脏提取的淀粉样沉积物含有ApoA-I 蛋白的氨基端（残基1～93）。从ApoA-I蛋白结构的3D 模型来看，残基174 的位置靠近第93 位的缬氨酸残基，也许是这个氨基酸残基的变化使得ApoA-I 蛋白容易从第93 位被切断。

第178 位的亮氨酸变为组氨酸（Leu78His）会造成心肌、咽喉和皮肤病变。 有趣的是，从皮肤提取到的淀粉样沉积不仅含有ApoA-I 蛋白的氨基端，还含有完整的甲状腺素和视黄醇转运蛋白（transthyretin，TTR）。 TTR 蛋白自身就可引起淀粉样变性病（见上文），TTR 蛋白在ApoA-I 蛋白沉积物中，说明引起淀粉样变性病的蛋白之间可相互作用，促进沉积物的形成。

即使没有ApoA-I 的基因突变，其蛋白的氨基端仍然可引起淀粉样变性病，说明其氨基端本身就有变为Prion 型结构的倾向。

例如一种ApoA-I 基团突变，在第107 位上形成的一个转译终止信号，结果只合成氨基端的106 个氨基酸残基。 该片段能形成淀粉样沉淀，沉积于主动脉（aorta）的内壁。ApoA-I 蛋白沉积或单独存在，或存在于动脉粥样硬化的斑块中。

膝盖淀粉样病变也可以由没有突变的ApoAI 蛋白的氨基端沉积引起。 从患者膝盖半月板（meniscus）提取的沉积物含有ApoA-I 蛋白的氨基端（残基1-60/77），可被刚果红染色并在偏振光显微镜上呈现双折射现象。

无变异的ApoA-I 蛋白也发现于有神经淀粉样病变的患者中。 患者腿部皮肤失去感觉，睡觉时小腿肌肉发生痉挛，后发生站立困难。 神经周围的单核细胞（mononuclear cell）和巨噬细胞（macrophage）内含有淀粉样沉积。 这些沉积中的蛋白为没有变异的ApoA-I 蛋白，能被刚果红染色并在偏振光显微镜上呈现双折射现象，说明是ApoA-I 蛋白形成的淀粉样沉积。

这些实例说明，即使是同一种蛋白，是否有氨基酸残基的变化，变化的位置和情形，都会影响Prion 型结构的细微特征，以及在身体中沉淀的位置，对蛋白致病的情形有很大的影响。

2.16 载脂蛋白A-II 引起的淀粉样变性病 另一个载脂蛋白，ApoA-II，也能引起淀粉样变性病。ApoA-II 是高密度脂蛋白中第2 多的蛋白（约占20%），分子量比ApoA-I 小得多，只含有77 个氨基酸残基，大小与ApoA-I 形成淀粉样沉积的氨基端部分的大小差不多。 然而ApoA-II 很少引起淀粉样变性病，原因也许是ApoA-II 分子高度亲脂，不容易从高密度脂蛋白上解离，即不容易形成游离的ApoA-II 分子，也就很少有改变分子结构的机会。

但是有一种基因突变改变了这种情形。 在为ApoA-II 蛋白最后一个氨基酸残基（谷氨酰胺）编码的DNA 序列后面，是一个转译终止码TGA。 在这里，一个G 到T 的突变使得TGA 变成了TTA，变为亮氨酸编码的三联码，原来的终止码消失。这样，ApoA-II 的转译就不在这里终止，而是再多合成21 个氨基酸残基，直到遇到后面的转译终止码为止（称为78Leuext21）。 这多出来的21 个氨基酸残基会改变ApoA-II 的折叠状况，从几乎全部为α－螺旋变为β－折叠。 这个形状改变也会影响ApoA-II 分子组入高密度脂蛋白的情形，使它变成聚积物，在身体器官中沉积下来引起疾病。

有此基因变化的患者为一位45 岁的女性，血液中肌酐（creatinine）水平升高，有蛋白尿，高血压，双腿肿胀，很快就需要肾透析。 为控制病情，医生切除了她的左肾，在换肾之后又切除了她的右肾。肾脏中的淀粉样沉积能被刚果红染色，并在偏振光显微镜下呈双折射现象。 抗体实验证明淀粉样沉积是由ApoA-II 蛋白组成的。 淀粉样沉积只在肾脏中发现，其他组织和器官中都没有发现ApoA-II 蛋白沉积。

即使没有基因突变，随着年龄的增加，蛋白合成和代谢途径发生变化，ApoA-II 也能引起疾病。一位68 岁的日本男性被发现有ApoA-II 蛋白沉积引起的肾病。 他没有肾病家族史，说明不是经由遗传获得的疾病，而是后天的。 他尿中的蛋白量逐渐增加。 肾脏活检发现有ApoA-II 蛋白沉积，但是没有其他更常见的引起肾病的蛋白例如抗体轻链等。

有趣的是，ApoA-II 蛋白在老年狗中引起淀粉样变性病的比例很高，且不需要基因突变即可引起疾病。 全长的ApoA-II 蛋白沉积在狗的重要器官，例如在肝脏、心脏、肾脏、肌肉中都有发现。

2.17 载脂蛋白A-IV 也能够引起淀粉样变性病

载脂蛋白A-IV（ApoA-IV）是结合在乳糜微粒（chylomicron）上的载脂蛋白。 ApoA-IV 在肠细胞中合成，由376 个氨基酸残基组成，几乎全部肽链都在β-螺旋中。然而，从一位92 岁死于淀粉样变性病的男性心脏中，却发现了ApoA-IV 蛋白的氨基端片段（大约残基1～70）。检查患者的ApoA-IV的基因，发现为蛋白编码的DNA 序列没有任何变化。 这位患者的心脏中同时有甲状腺素和视黄醇转运蛋白（transthyretin，TTR，见上文）的沉积，但这2 种蛋白并不沉积在一起，而是各自形成自己的沉积。

上面介绍的，只是迄今为止发现的淀粉样变性病的一部分，但从这些病例，已经可以看到这类蛋白的致病机制：虽然它们的氨基酸序列不同，但通过肽链折叠方式改变形成的结构却是高度相似的，都是横向的β-折叠重叠在一起，形成小纤维状的结构。正是这样的结构，或这些结构形成过程中的低度聚合物，对细胞和组织有伤害性。

虽然这些小纤维的总体结构相似，但根据蛋白原来的表达位置，具体的蛋白氨基酸序列，以及人体的状况，都能影响这些聚合物沉积的位置，引起不同的疾病。 例如Prion 蛋白和Aβ 片段、α-突触核蛋白和Huntingtin 蛋白本来就是在中枢神经系统中高度表达的，它们引起的淀粉样沉积也主要在中枢神经系统中，在那里引起疾病。而抗体轻链和重链、血浆A 蛋白，β-微球蛋白、甲状腺素和视黄醇转运蛋白（TTR）、胰岛淀粉样蛋白Amylin、纤维蛋白原、胱抑素蛋白、载脂蛋白都是存在于血浆中的，它们可以沉积在体内各种组织和器官内，引起疾病。 溶菌酶、超氧化物歧化酶中的SOD3 存在于细胞外，它们也沉积于细胞外。

从多种蛋白都能改变折叠状况，形成致病性的Prion 类型的蛋白沉积物来看，蛋白的结构，或者说肽链的折叠状况，是很容易受到扰乱而改变的。 脱离原来结合的分子（例如抗体的轻链和重链、β-微球蛋白、载脂蛋白A）、有形成Prion 型结构能力的肽链段从整体分子中脱离出来（例如Aβ肽链、载脂蛋白和血清蛋白A 的氨基端部分）、基因突变造成的氨基酸改变、肽链延长（例如ApoAII 蛋白）、肽链缩短（例如ApoA-I 肽链的合成提前终止）、老年时肌体维持蛋白正确折叠的功能下降（例如ApoII 在没有基因突变的情况下在老年人身上引起淀粉样变性病）等，都能改变肽链中电荷的相互作用情形，导致折叠方式改变。

以上介绍的引起淀粉样变性病的蛋白都是存在于哺乳动物中，特别是人体中的。既然许多蛋白都有改变折叠方式的可能性，传染性蛋白就不应该只在高等动物中才出现，而应该在比较低等的生物中就已经存在。 近年来的科学研究也证实了这一点。 例如在酵母中，就有能形成Prion 结构的蛋白质，即传染性蛋白质。

（待续）