氟比洛芬淀粉酯的酶促合成

段春影,王金龙,于志超

(齐齐哈尔工程学院 管理工程系,黑龙江 齐齐哈尔 150030)

氟比洛芬是新一代的非甾体抗炎药,具有消炎、止痛和退热功能,临床上多用于治疗肌肉、骨骼和关节的疼痛[1-2]。氟比洛芬的物理性质主要表现为白色或类白色结晶性粉末,不溶于水,易溶于有机溶剂,熔点为114～117 ℃[3]。氟比洛芬通过抑制身体内某种酶的活性，从而达到镇痛的作用。目前，氟比洛芬缓释胶囊剂已在日本上市,该药口服有效、耐受性好,长期使用不会对身体代谢造成伤害。此外,还有栓剂、亲水凝胶骨架片、固体分散体等制剂正在研究中。氟比洛芬分子中有一个氟原子,氟原子的独特性能使其在同类药物中作用较强,治疗剂量小,副作用较低[4]。

氟比洛芬酯是非甾体抗炎药氟比洛芬的酯类前体药物,对癌症性疼痛和术后疼痛的临床疗效明显。超前镇痛,指在中枢神经系统敏感化之前,通过使用药物,消除或减轻术后疼痛[5]。非甾体抗炎药的作用机理主要是通过抑制环氧合酶,使外周和中枢前列腺素的含量降低,从而抑制外周和中枢的活性,进而减轻有害刺激引起的疼痛反应[6]。有研究报道:在甲状腺切除手术中,氟比洛芬酯的超前镇痛作用能够显著减少麻醉药品的使用量[7]。

本研究通过单因素实验和正交试验,确定制备氟比洛芬淀粉酯的最佳工艺条件,为接下来的相关研究提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉,黑龙江龙凤玉米开发有限公司;氟比洛芬,太仓运通生物化工有限公司;Novozym 435,诺维信公司;异辛烷,山东桦超化工有限公司;无水乙醇,天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BSA220S-CW精密天平，Sartorius公司;BSA224S-CW分析天平，Sartorius公司;EMS-8C恒温磁力搅拌器，天津欧诺仪器仪表有限公司;DHG-9053A电热恒温干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;2-16k高速冷冻离心机，Sigma公司;JJ-1精密定式电动搅拌器，江苏荣华仪器制造有限公司;旋光仪;紫外高效液相色谱仪。

1.3 方法

1.3.1 玉米淀粉的预处理方法

将质量比为2 ∶1的氢氧化钠和尿素加入100 mL去离子水，配制成浓度为9%的氢氧化钠/尿素混合溶液,置于冰箱中冷却至-12 ℃左右;在快速搅拌下缓慢加入5%的干基玉米淀粉,继续搅拌至形成透明、均匀的淀粉糊;滴加稀盐酸至中性,再慢慢滴加无水乙醇使淀粉沉淀析出;用95%乙醇溶液洗涤析出的淀粉数次直至无氯离子,再用无水乙醇洗涤以脱去水分,50 ℃真空干燥12 h,得到预处理淀粉。

1.3.2 氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工艺流程

氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工艺流程见图1。

图1 氟比洛芬淀粉酯的酶催化合成工艺流程

1.3.3 氟比洛芬淀粉酯合成单因素实验

1.3.3.1 底物质量比对酶促反应的影响

氟比洛芬与预处理淀粉的质量比分别为0.5∶1、1∶1、1∶2、1∶3、2∶1,反应时间为6 d,反应温度为50 ℃,酶添加量为3%。利用旋光仪和紫外分光光度计对反应产物进行测定,得出不同质量配比条件下的旋光度和吸光度,然后计算反应产物的转化率和EEp。

1.3.3.2 反应温度对酶促反应的影响

反应温度的变化范围为50～70 ℃,间隔温度为5 ℃,反应时间为6 d,氟比洛芬与预处理淀粉的质量比为1∶2,酶添加量为3%。利用旋光仪和紫外分光光度计对反应产物进行测定,得出不同反应温度条件下的旋光度和吸光度,然后计算反应产物的转化率和EEp。

1.3.3.3 反应时间对酶促反应的影响

反应时间的变化范围为3～7 d,间隔时间为1 d,反应温度为50 ℃,氟比洛芬与预处理淀粉的质量比为1∶2,酶添加量为3%。利用旋光仪和紫外分光光度计对反应产物进行测定,得出不同反应时间条件下的旋光度和吸光度,然后计算反应产物的转化率和EEp。

1.3.3.4 酶添加量对酶促反应的影响

酶添加量分别为3%、5%、7%、9%,间隔用量为2%,反应温度为50 ℃,反应时间为6 d,氟比洛芬与预处理淀粉的质量比为1∶2。利用旋光仪和紫外分光光度计对反应产物进行测定,得出不同酶添加量条件下的旋光度和吸光度,然后计算反应产物的转化率和EEp。

1.3.4 酶促酯化反应工艺条件的优化

在单因素实验的基础上,设计L9(34)正交试验(见表1)。初始水活度控制在0.1,以氟比洛芬的转化率和产物对映体过量值作为评价指标。

1.3.5 旋光值和吸光度的测定

1.3.5.1 旋光值的测定

表1 正交试验因素水平表

在反应好的产物中加入47 mL异辛烷，将其彻底溶开,然后将旋光仪打开预热10 min,选择1 dm长度的旋光管进行测量,在测量之前注意用异辛烷进行调零。

1.3.5.2 吸光度的测定

用721分光光度计在294 nm处测量每组产物的吸光度,在测量之前用异辛烷进行调零,然后将反应后的样品倒入比色皿,从而得出实验数据。

1.3.6 计算方法

首先利用旋光仪测出旋光度,根据公式[α] Dt=αDt/Ld=αDt/Lc进行计算,其中,L是旋光管的长度,c是测定液的浓度;然后利用C%=M剩/M原,计算产物的转化率;再利用EEs=[α]Dt/77求出EEs;最后根据EEp=EEs×(1-C)/C,得出产物的对映体过量值。

1.3.7 标准曲线的绘制

称取1g氟比洛芬原料药置于10 mL容量瓶中,加入适量的pH 7.4磷酸盐缓冲液，使其充分溶解,以空白灌流液定容配制成质量浓度为1 mg·L-1的标准液。分别精密移取不同体积的氟比洛芬标准液至容量瓶中,以空白灌流液定容配制成质量浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mg/L的氟比洛芬系列标准液,根据氟比洛芬的浓度和吸光度进行线性回归计算。

1.3.8 数据统计与分析

重复测定3次,取测定数据的平均值,通过SPSS软件进行数据处理,采用Microsoft Excel 2003软件制图。

2 结果与讨论

2.1 氟比洛芬标准曲线的绘制

在实验条件下,以吸光度(Y)为纵坐标、氟比洛芬的浓度(X)为横坐标,绘制标准工作曲线。氟比洛芬标准液的浓度范围在0.05～0.50 mg/L。由图2可以看出,吸光度与氟比洛芬的浓度呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99。氟比洛芬的标准曲线方程是y=7.04x+0.172,R2=0.997。

图2 氟比洛芬的标准曲线

2.2 氟比洛芬淀粉酯合成单因素实验结果

2.2.1 底物质量比对酶促反应的影响

由图3可知,当底物质量比为0.5 ∶1时，EEp最高,但是产物转化率仅为13%;当底物质量比为1∶2时,产物转化率和EEp分别为25.6%和40.2%。综合考虑,在底物质量比为1∶2的条件下,氟比洛芬淀粉酯的转化率和EEp为最佳。

图3 底物质量比对酶促反应的影响

2.2.2 反应温度对酶促反应的影响

在酶添加量、反应时间及底物质量比不变的条件下,反应温度对氟比洛芬淀粉酯的转化率及EEp的影响见图4。在反应温度为60 ℃时,氟比洛芬淀粉酯的转化率为28.3%,对映体过量值EEp为35.4%。转化率随着温度的升高而不断增长,但是当温度过高时,酶的活性受到影响,所以增长趋势逐渐减缓。对映体过量值随着温度的升高呈下降趋势。综合考虑,当反应温度为60 ℃时,产物转化率和对映体过量值EEp为最佳。

图4 反应温度对酶促反应的影响

2.2.3 反应时间对酶促反应的影响

在其他反应条件不变的情况下,反应时间对氟比洛芬淀粉酯的转化率及EEp的影响见图5。随着时间的延长,氟比洛芬淀粉酯转化率从12.3%增长到29.7%,而对映体过量值EEp从35.6%降到26.5%。在反应时间为4 d时,转化率和EEp分别为22.3%和33.4%。综合考虑,当反应时间为4 d时,产物转化率和对映体过量值EEp为最佳。

图5 反应时间对酶促反应的影响

2.2.4 酶添加量对酶促反应的影响

在其他反应条件不变的情况下,酶添加量对氟比洛芬淀粉酯的转化率及EEp的影响见图6。当酶添加量为5%时,产物转化率和EEp分别为15.6%和34.8%。随着酶添加量的增加,产物转化率也相应提高,但对映体过量值随着酶添加量的增加呈下降趋势。综合考虑,当酶添加量为5%时,产物转化率和对映体过量值EEp为最佳。

图6 酶添加量对酶促反应的影响

2.3 氟比洛芬淀粉酯合成正交试验结果

从表2可以看出,氟比洛芬淀粉酯极差R值的变动范围在0.028～0.204时,酶添加量的影响最大,反应温度的影响最小。通过正交试验，确定制备氟比洛芬淀粉酯的最佳工艺条件为A2B1C2D2,即酶添加量5%、反应时间4 d、底物比1∶2、反应温度60 ℃,在此条件下,产物转化率为35%，对映体过量值EEp为55.45%。

表2 正交试验结果

3 结论

外消旋体的拆分方法包括物理、化学、生物、色谱、萃取和分子印迹等拆分法。物理拆分法[8-9]主要是利用一定温度下某一旋光异构体的溶解度比外消旋体小的原理,通过加入单一的旋光异构体,使其析出异构体的结晶,最终获得单一对映体。它是最原始、最经济的方法,但是该方法的收率低,过程烦琐,对于工业化生产并不适用。目前,最常用的是化学拆分法[10],主要是通过结晶和重结晶的方法对某种对映体进行提纯分离。

一般采用脂酶催化酯交换的方法获得R-2-苯氧基丙酸衍生物时,可以通过加入甲醇钠,在加热的条件下对无效的 S-2-苯氧基丙酸衍生物进行不断的消旋化[11],进而使分子达到最大程度的拆分。廖本仁等[12]以取代水杨醛为消旋催化剂,在扁桃酸手性助剂作用下实现了苯甘氨酰胺的动态动力学拆分,其单程收率超过82%,光学纯度达99%。

随着固定化酶技术的不断发展,酶拆分技术在手性拆分中有着良好的前景。生物拆分法现已广泛应用于手性醇[13]、胺类药物[14]、氨基酸[15-16]等的手性拆分中。徐刚等[17]对不同来源的酶进行筛选,选出两种选择性较强的酶用于拆分2-氯-1-(2-噻吩)-乙醇,其对映体过量值高达98.5%。由于氟比洛芬有R、S两种构型,而435脂肪酶只对R型有专一作用,因此可以将氟比洛芬酯化拆分,从而得到在医疗方面更有用的R型。在酯化过程中,淀粉主要起到缓释作用,减轻药物对肠胃的副作用。

本文通过单因素实验和正交试验,确定制备氟比洛芬淀粉酯的最佳工艺条件:酶添加量5%、反应时间4 d、底物比1∶2、反应温度60 ℃。在此条件下,产物转化率为35%，对映体过量值EEp为55.45%。

[1]BLENAU W,BAUMANN A. Molecular and pharmacological properties of insect biogenic amine receptors: lessons from drosophila melanogaster and apis mellifera [J].Archives of insect biochemistry and physiology,2001(1):13-38.

[2]石劲敏,邓巧林,李端.2-芳基丙酸类药物的立体选择性药效学及药动学[J].中国药理学通报,2003(4):379-383.

[3]LIU Z H,LIU K X. The transporters of intestinal tract and their study methods [J].Acta pharmaceutica sinica,2011(4):370-376.

[4]樊德厚,王永利.中国药物大全:西药卷[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005.

[5]俞卫锋.麻醉与复苏新论[M].上海:上海第二军医大学出版社,2001.

[6]米勒.米勒麻醉学[M].7版.曾因明,邓小明,译.北京:北京大学医学出版社,2006.

[7]ZHANG Z,ZHAO H,WANG C,et al. Lack of preemptive analgesia by intravenous flurbiprofen in thyroid gland surgery: a randomized, double-blind and placebo-controlled clinical trial [J].International journal of medical sciences,2011(8):433-438.

[8]黄蓓,杨立荣,吴坚平.手性拆分技术的工业应用[J].化工进展,2002(6):375-380.

[9]尤田耙.手性化合物的现代研究方法[M].合肥:中国科学技术大学出版社,1993.

[10]戴震,王大慧.概述手性药物的研究与制备[J].江苏药学与临床研究,2003(5):24-27.

[11]ROGER A SHELDON,郑雪珠.纯对映体药物的工业合成[J].药学进展,1991(3):148-154.

[12]廖本仁,安国成,竹俊如,等.苯甘氨酰胺结晶诱导的动态动力学拆分[J].有机化学,2011(9):1495-1498.

[13]VAKHLU J,JOHRI S,VERMA V. Purification and properties of enantioselective ester hydrolase from a strain of trichosporon species [J].Enzyme and microbial technology,2005(3):330-339.

[14]KOSJEK B,TELLERS D M,BIBA M,et al. Biocatalytic and chemocatalytic approaches to the highly stereoselective 1,2-reduction of an α,β-unsaturated ketone [J].Tetrahedron: asymmetry,2006(19):2798-2803.

[15]ZIMMERMANN V,BELLER M,KRAGL U. Modelling the reaction course of a dynamic kinetic resolution of amino acid derivatives: identifying and overcoming bottlenecks [J].Organic process research & development,2006(3):622-627.

[16]丁国钰,彭佳敏,郭婷婷,等.利用色氨酸酶酶法拆分D,L-丝氨酸制备D-丝氨酸[J].精细化工,2012(10):947-951.

[17]徐刚,程咏梅,吴坚平,等.有机相酶催化拆分制备(S)-2-氯-1-(2-噻吩)-乙醇[J].有机化学,2007(7):857-861.