橘子皮中陈皮甙的提取及性能研究

张 帆,郑敏燕,郭 颖,魏永生

(咸阳师范学院 化学与化工学院,陕西 咸阳 712000)

橘子皮是芸香科植物橘(Citrus Reticulate Blanco)及其栽培变种的成熟果皮,俗称桔子皮。中药陈皮又名贵老,有很高的药用价值[1],其气香,味苦辛,性温,归脾、肺经,能理气健脾,燥湿化痰[2]。陈皮甙是橘子皮中的主要成分之一[3],与陈皮甙共存于橘子皮中的黄酮类化合物有新陈皮甙、柑桔黄甙、橙皮黄素、酸橙黄素等。橘子皮中还有中性内酯类苦味质柠檬素及挥发油等成分。陈皮甙对肠管有兴奋作用,能降低毛细血管通透性,有健胃、止泻、祛痰、驱风、镇呕等药理活性[4],也是羟基自由基(·OH)和超氧自由基等对人体有害的自由基的清除剂[5],可以延缓衰老。陈皮可应用于食品、药品、保健品、精细化工品等行业[6]。

目前,关于从橘子皮中提取陈皮甙的方法的研究较多,主要有碱液提取法、热水提取法、醇提法、索氏提取法、微波辅助提取法、超声波强化提取法、超临界CO2萃取法等[7-8]。最经济实用的提取方法一般是超声波辅助乙醇提法,设备易得,溶剂可回收再用,提取条件温和,提取率较高。本研究以干橘子皮为原料提取陈皮甙,用超声波辅助乙醇提法确定陈皮甙的最佳提取工艺条件,并测试陈皮甙的抗氧化活性,为橘子皮资源的开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂和材料

仪器:UV-6300PC型紫外可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司;FA214电子天平,梅特勒-托利多仪器有限公司;RE-2000E旋转蒸发器,上海科升仪器有限公司;SB-4200DTD超声波清洗机,宁波新芝生物科技股份有限公司;HH-系列恒温水浴锅,河北省黄骏市渤海电器厂;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱,上海祁欣科学仪器有限公司;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司;抽滤瓶、布氏漏斗、索式提取器及玻璃仪器,天津市化玻仪器有限公司。

试剂:陈皮甙对照品，购置于中国药品生物制品检验所;95%乙醇、甲醇、乙醚、硝酸铝、浓盐酸、镁粉、邻二氮菲、过氧化氢、硫酸亚铁、三氯化铝、磷酸等,均为分析纯,西安化学试剂厂。0.75 mmol邻二氮菲溶液、0.75 mmol硫酸亚铁溶液、pH=7.4的磷酸缓冲溶液,临时配制。

材料:橘子皮，于2015年11月上旬收集于陕西南部的秦巴山区,经过鉴定,确认是成熟橘子的外皮。将橘子皮置于烘箱中,保持50 ℃烘干,粉碎后过200目筛,密封备用。

1.2 实验方法

1.2.1 橘子皮中陈皮甙提取率的确定

准确称取陈皮甙对照品0.3750 mg,用乙醇定容,分别配置成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mg/mL的陈皮甙对照品溶液,取4支10 mL的具塞试管，均加入陈皮甙对照品溶液4 mL,再分别加入1 mL 10%的硝酸铝溶液,置于80 ℃的水浴锅中反应15 min,并定容至10 mL,在最大波长420 nm处用乙醇溶液作为参比,测定其吸光度,平行次数3次,取平均值。可得标准回归曲线方程为:y=23.200x+0.0166,R2=0.9999,其中，x指标准品的浓度(mg/mL),y为吸光度。称取1.000 g橘子皮粉末,放入小型索氏提取器的滤纸桶里,用乙醚回流提取至无色，以除去脂溶性物质,回收乙醚[9]。将橘子皮粉末取出,晾干后放入塑料提取管,以乙醇溶液为提取溶剂,用超声波辅助提取技术在不同的固液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度等条件下提取橘子皮中的陈皮甙,抽滤,将橘子皮粉末用同样方法再提取一次,将滤液一起转移到100 mL容量瓶中,洗涤,用乙醇溶液定容。取待测样品4 mL放入10 mL具塞试管,加入1 mL 10%的硝酸铝溶液,置于80 ℃的水浴锅中反应15 min,并定容至10 mL,测定样品时,以硝酸铝试剂作为空白，在420 nm处测定其吸光度,根据标准曲线回归线方程确定陈皮甙的提取率。

1.2.2 陈皮甙提取工艺条件的优化

采取超声波辅助提取法,在超声波功率为400 W、工作频率为40 KHz条件下考察固液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度等因素对陈皮甙提取率的影响。实验中,固液比为1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21(g/mL);乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%;提取温度为50、60、70、80、90 ℃；提取时间为5、15、25、35、45 min。在单因素实验基础上,设计四因素三水平L9(34)正交试验进行优化,以确定超声波辅助下陈皮甙提取的最佳工艺条件。

1.2.3 陈皮甙的定性检测

在最佳工艺条件下提取陈皮甙,用10 mL甲醇将陈皮甙配成质量百分比浓度为2%的陈皮甙甲醇溶液。通过陈皮甙与金属离子的颜色反应、还原性反应定性检测从橘子皮中提取的陈皮甙。与金属离子反应:取陈皮甙少许置于试管中,加甲醇2 mL,在水浴中加热溶解;加1%三氯化铝试剂2～3滴,颜色呈鲜黄色。还原性反应:取陈皮甙少许置于试管中,加乙醇2 mL,在水浴中加热溶解,然后向其中加入镁粉约50 mg,振摇后,滴加浓盐酸3～4滴,产生剧烈反应,溶液逐渐由浅黄色变为红色。

1.2.4 陈皮甙对羟基自由基清除率的测定

用邻二氮菲-Fe2+氧化法测定Fe2+/H2O2体系中的·OH清除率。配制50 mL浓度为0.30 mg/mL的陈皮甙水溶液,取6支25.0 mL已编号的容量瓶,在每支瓶中加入1.0 mL 0.75 mmol/L邻二氮菲溶液及0.2 mol/L(pH=7.4)的PBS缓冲溶液1.5 mL,混合均匀后再加入1.0 mL新配置的0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液,然后向1～6号容量瓶中分别加入2、4、6、8、10、12 mL的陈皮甙水溶液,摇匀后,再向每支容量瓶中加入新配制的0.01%过氧化氢各1 mL。另取2支25.0 mL的容量瓶并分别标记为损伤管、未损伤管,在损伤管中加入0.01%的过氧化氢1 mL,未损伤管中不加过氧化氢。然后,用蒸馏水将8支容量瓶定容至刻度线,充分摇匀,在37 ℃的生化培养箱中培养1 h后取出,冷却至室温,在波长为510 nm下测量样品的吸光度A,平行测三次,取平均值。对·OH清除率计算公式为:I(%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100%。其中,A2为陈皮甙水溶液的吸光度，A1为未损伤溶液的吸光度，A0为损伤溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 固液比对陈皮甙提取率的影响

实验条件如下：提取温度为80 ℃,乙醇浓度为80%,固液比分别为1∶5、1∶9、1∶13、1∶17、1∶21,在超声波清洗机中提取35 min。固液比对陈皮甙提取率的影响如图1所示。在温度和乙醇浓度一定的条件下,当固液比为1∶17时,橘子皮中陈皮甙的提取率最高。溶剂过少或过多都会影响陈皮甙的提取率:溶剂过少,溶解不充分,不利于陈皮甙分子扩散;溶剂过多,耗损能量,使超声波对陈皮甙分子的作用力减小。因此,选定固液比为1∶17。

图1 固液比对提取率的影响

2.1.2 乙醇浓度对陈皮甙提取率的影响

提取温度为80 ℃,固液比为1∶17,乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%,在超声波清洗机中提取35 min。乙醇浓度对陈皮甙提取率的影响如图2所示。在温度、固液比、时间一定的条件下,乙醇浓度为80%时,橘子皮中陈皮甙的提取率最高,可达6.11%;当乙醇浓度高于80%时,陈皮甙的提取率明显下降。可见，乙醇浓度对提取率有较大影响。乙醇浓度过高时会抑制陈皮甙分子溶出,这与陈皮甙分子的糖体不易溶于高浓度乙醇溶液的结果相一致。因此,确定乙醇浓度为80%。

图2 乙醇浓度对提取率的影响

2.1.3 温度对浸提效果的影响

固液比为1∶17、乙醇浓度为80%,温度分别为50、60、70、80、90 ℃，在超声波清洗机中提取35 min。提取温度对陈皮甙提取率的影响如图3所示。当温度为80 ℃时,橘子皮中陈皮甙的提取率最高,为6.09%。提取温度过低不利于陈皮甙的析出；陈皮甙的提取率随着温度的升高而升高；当温度超过80 ℃时，提取率开始下降,提取液在较高温度时在超声波辅助下会使陈皮甙降解。应选择在乙醇溶液微沸的状态下从橘子皮中提取陈皮甙,确定提取温度为80 ℃。

图3 提取温度对提取率的影响

2.1.4 提取时间对浸提效果的影响

固液比为1∶17、乙醇浓度为80%、提取温度为80 ℃，提取时间分别为5、15、25、35、45 min,在超声波清洗机中提取陈皮甙。提取时间对陈皮甙提取率的影响如图4所示。在5～35 min时,陈皮甙的提取率持续递增;陈皮甙的提取率在35 min后开始下降;较长时间的超声波处理和持续的加热会使陈皮甙中的部分糖甙键断裂,使其提取率降低。选定提取时间为35 min。

图4 提取时间对提取率的影响

2.2 正交试验

在固液比、提取液浓度、提取温度及提取时间等单因素实验结果的基础上,依据各因素的选取范围,设计四因素三水平L9(34)正交试验表进行研究,以优化和确定陈皮甙的最佳提取工艺条件。因素水平见表1,正交试验结果如表2所示。

表1 试验因素水平

表2 正交试验结果

续表:

由表2可知,影响陈皮甙提取率的主次因素为:乙醇浓度>固液比>提取温度>提取时间。最佳工艺条件为:超声波功率400 W,工作频率40 KHz,固液比1∶17,乙醇浓度80%,温度80 ℃，提取时间35 min。在该工艺条件下进行验证,实验平行3次,取平均值,得到陈皮甙的提取率为6.60%。验证实验结果与正交试验结果基本一致,说明该提取工艺有可行性,重现性好,陈皮甙的提取率稳定,适合中小企业批量生产。

2.3 陈皮甙的显色

从橘子皮中提取的陈皮甙经定性检验,其显色实验结果对比如图5所示。从左至右,第一个试管中是未加浓盐酸和镁粉的陈皮甙乙醇溶液,溶液呈浅黄色;第二个试管是第一个试管的对照品,其中是加入浓盐酸和镁粉的陈皮甙乙醇溶液,溶液由浅黄色变为红色。第三个试管中是未加三氯化铝的陈皮甙甲醇溶液,溶液呈浅黄色;第四个试管是第三个试管的对照品,里面是加了三氯化铝的陈皮甙甲醇溶液,溶液由浅黄色变为鲜黄色,说明从橘子皮中可以提取陈皮甙。

图5 陈皮甙的显色实验

2.4 陈皮甙对·OH的清除作用

陈皮甙对·OH的清除实验结果如图6所示。随着陈皮甙水溶液浓度的增大,陈皮甙对·OH的清除率呈现增高趋势,陈皮甙的用量与·OH的清除率之间存在量效关系,陈皮甙对·OH有很好的清除作用。实验平行进行3次,由图6中的曲线可以看出陈皮甙对·OH的清除作用明显且稳定。随着陈皮甙浓度的增大,对·OH的清除率不断提高,说明陈皮甙具有抗氧化活性。

图6 陈皮甙对·OH的清除作用

3 结论

在功率400 W、工作频率40 KHz的超声波辅助作用下,考察固液比、乙醇浓度、提取时间和提取温度等单因素对陈皮甙提取率的影响。通过四因素三水平正交试验确定从橘子皮中提取陈皮甙的最佳工艺提取条件为:固液比1∶17(g/mL),乙醇浓度80%,提取温度80 ℃,提取时间35 min。在该工艺条件下,陈皮甙的提取率可达6.6%。此工艺可为中小企业规模化生产提供前期的技术支撑。从橘子皮中提取陈皮甙进行定性检验,结果说明可从橘子皮中提取陈皮甙。通过Fe2+/H2O2体系测试陈皮甙清除·OH的效果,结果显示陈皮甙对·OH有明显的清除作用,且陈皮甙的用量与·OH的清除率之间存在量效关系,这为陈皮甙的应用提供了参考。本研究仅初步从橘子皮中提取陈皮甙,并对陈皮甙清除·OH的效果进行测试,关于陈皮甙的其他生物活性及其构效关系有待深入研究。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[Z].北京:中国医药科技出版社, 2015:191.

[2]刘潘隽丽,杨翠平,苏薇薇.枳壳类药材的研究概况[J].中药材,2003(10):23-26.

[3]宋玉鹏, 陈海芳,谭舒舒, 等.不同陈皮来源药材中橙皮苷、川陈皮素、橘皮素和辛弗林的含量比较[J].时珍国医国药, 2017, 28(9):2061-2064.

[4]文高艳,周贤梅.陈皮有效成分在呼吸系统中的作用研究[J].现代中西医结合杂志,2011,20(3):385-386.

[5]黄芳, 周宏, 陈华,等.橘皮中橙皮苷提取的优化及其对羟自由基清除作用[J].食品与发酵工业, 2012, 38(5):223-228.

[6]信维平,孙建华,祁宏.陈皮中陈皮甙的提取和应用的研究[J].食品研究与开发,2006,27(1):23-25.

[7]成超,韩德花,鲍正荣.陈皮中橙皮甙浸出方式研究[J].成都中医药大学学报,2005,28(4):53-54.

[8]耿敬章,刘军海,吴三桥.柑橘皮渣橘皮苷的提取及其抑菌性质研究[J].食品工业,2014,35(8):87-91.

[9]刘存芳,史娟,张强.橘皮多糖超声辅助提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品与机械,2016,32(8):147-150.