工业微生物菌种的保藏方法

王 利

海正药业（杭州）有限公司 浙江 杭州 311404

正文：

微生物资源是我国重要的战略生物资源。微生物产业已成为继动植物之后的第三大生物产业。欧美发达国家生产总值的8%-12%与微生物有关。微生物产业产值不断增长，在工业、农业、林业、医药、环境、能源等诸多领域发挥着重要作用。工业微生物菌株作为生物发酵生产的源头，对发酵工业产品的产量和质量有着重要的影响，是保证发酵产品质量稳定的关键环节。保存方法的合理与否对保持菌株的优良特性至关重要。

1 概述

1.1 微生物菌株的定义是一个基本的分类单元，是表型特征高度相似、关系密切、与同属其他菌株差异明显的一大类菌株的总称。目前工业生产中最常见的微生物是细菌、放线菌和真菌。

1.2 微生物菌株在繁殖过程中会受到环境条件的影响而不断变化，大部分变化与工业生产目标的预期不一致，为负变化。在工业生产中，由于重要性状属于数量性状，因此具有负向变化的倾向。随着代数的增加，当阴性细胞占有一定优势时，细菌就会发生降解。正确的保存方法是在保存过程中减少细菌的自发性传播，从而减少细菌降解的机会

1.3 一般是通过菌株在缺氧、缺水、低温、低营养条件下的贮藏来抑制菌株的新陈代谢，使其通过停滞甚至进入休眠状态。在实践中，低温保存细菌的效果往往更好。例如-195(-液氮或低温冰箱)的效果优于-70(-干冰或低温冰箱)，-70℃优于-20℃，-20℃优于4℃。

2 工业微生物菌种的保存方法

2.1 边坡低温保存方法。

细菌应该每月移植一次。倾斜应变应连续保存三代，以控制和防止事故和污染造成的损失。该方法的孵育时间和温度影响其保鲜质量。培养时间短，保鲜过程中容易死亡，培养时间长，生产效率高。这种方法常用于实验室储存。其优点是保存操作简单，菌株使用方便，没有特殊设备，能够对保存菌株进行死亡、突变和污染检测。适用于不需要长期保存或冻干保存的菌株。该方法的缺点是贮存时间短，菌株易发生突变，菌株在贮存过程中维护多样，菌株容易被污染。

2.2 液体石蜡的保存。

矿物油保藏法，又称矿物油保藏法，是常规移植保藏法的补充方法，由法国吕米埃于1914年创立。具体操作如下:(1)选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡单独包装并塞好，用牛皮纸包好，用湿热灭菌(灭菌后烘干)或干热灭菌对石蜡进行灭菌，无菌检查后保存。(2)斜培养获得较强的真菌或孢子。(3)在无菌条件下，将石蜡注入细菌生长的斜坡。石蜡的用量应比坡顶高1厘米，以隔离空气中的细菌。该方法实用有效。真菌、放线菌和孢子菌可保藏2-10年，酵母可保藏1-2年，非孢子菌可保藏1年左右，即使是一般方法难以保藏的脑膜炎球菌也可保藏3个月。此外，本方法不适用于石蜡为碳源的微生物保藏或对石蜡特别敏感的微生物保藏。

2.3 干燥保存方法。

微生物芽孢或芽孢在干燥环境中对死亡的抵抗力很强，干燥可以使其代谢活性降低到休眠状态。干保存法是将菌株接种到合适的材料中，人为创造干燥环境，达到菌株保存的目的。干燥保鲜的载体可以是沙子、滤纸、硅胶、麦麸等。干燥保鲜的方法有冷冻干燥和真空干燥。以滤纸保藏方法为例，将细胞或孢子吸附在湿无菌滤纸上，干燥后低温(如4c)保存，细菌和酵母可以保存2年左右，一些丝状真菌甚至可以保存14-17年。该方法具有贮存时间长、维护简单、无特殊设备等优点。

2.4 超低温保存方法

该方法通常将菌株保存在液氮或低温-150～195c的冰箱中，甘油和二甲基亚砜通常用作菌株的保护剂。通常微生物的代谢几乎完全停滞在-130摄氏度以下，因此低温贮藏被认为是世界上最有效的防止细菌降解的方法。随着制冷技术的发展，超低温保鲜已有几十年的历史，广泛应用于工业发酵菌种的保鲜。本方法适用于各种微生物菌株的保存，包括支原体、原生动物、藻类等。该方法将含有保护剂的细菌悬液密封在无菌冷冻管中，然后缓慢冷冻。理想的冷却和速冻温度为1C/min。当温度逐渐下降到-35c时，微生物悬液迅速被放入液氮罐或深冷冰箱中。当细菌再次培养时，它们需要迅速融化，然后在适当的温度下在液体培养基中培养。

2.5 上述方法可以根据菌株本身的特点、菌株保存的目的以及实验室的具体条件和需要进行选择。特定的保存方法(包括保护剂的选择)应该通过实验,来研究,最好是为每个应变采用以上两种方法,并根据保存菌株的保质期,定期进行恢复测试和更新菌株进入。

3 对我国细菌保护的思考与建议

3.1 加强统筹规划。我国文物保护中心的数量比较多，且规模比较大，管理内容比较复杂，所以，在实际管理的时候，很容易出现管理混乱问题，无法有效保障管理质量。为了保证微生物资源的管理效果，应建立起专门的微生物资源体系，并将其统一保存在储存机构，各个保存机构应根据地区的环境特点以及自然条件来进行菌株保存。每个机构都有自己的职能，可以互补彼此的优势。例如，一个或几个保存机构专注于真菌，而其他机构专注于病毒。

3.2 建立专项运营组织。我国必须要加强对细菌保管机构管理的重视，建立起专门的细菌菌株保管机构，确保菌株可以得到有效保管。同时，还需要对菌株订购信息进行不断的更新，运营机构应根据菌种的实际特点，来选择合理、可行的运营模式，并采用各种运营手段，来增加用户数量，使细菌市场得到有效扩展。

3.3 建设信息平台。确保信息共享，并防止资源浪费问题的发生，促进国内外保护组织的交流与合作。中国应该建立一套通用的互联网信息平台，将国内大大小小的菌种库连接起来，形成信息网络，实现资源的交换。每个应变存储单元都可以依赖于同一个大数据存储系统，借助软件的帮助，可以将所有应变信息录入系统，并与网络同步，供每个单元进行查阅和交换。