瘦素预处理的MSC体外调节SLE患者淋巴细胞亚群的初步研究①

陈海凤 邹耀红 孙凌云

(南京医科大学附属无锡人民医院风湿免疫科，无锡 214023)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种自身免疫性疾病，主要表现为自身抗体生成、多器官受累，其发病机制在于T、B淋巴细胞免疫异常，大量自身反应性淋巴细胞浸润及免疫复合物沉积等致靶器官损伤[1]。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是一种非造血、多潜能的祖细胞，可分化成脂肪细胞、成骨细胞、肌细胞等，因其低免疫原性及免疫调节作用，近年来在自身免疫病方面的作用得到了较多关注。大量研究表明MSC移植治疗MRL/lpr鼠或狼疮患者，均可缓解狼疮病情[2]。MSC可抑制T、B淋巴细胞活化增殖及减少抗体生成，如调节性T(Treg)细胞[3]、Th17细胞[4]、滤泡辅助T(Tfh)细胞[5]、B淋巴细胞[6]等。

SLE患者自体骨髓MSC已证实存在异常，表现在迁移、衰老及凋亡等方面，其对免疫细胞的调节作用亦明显受损[2，7-9]。此外，我们前期研究发现SLE血清微环境体外可加剧MSC异常衰老[10]，其中异常升高的瘦素起到主导作用[11]。然而瘦素除诱导MSC衰老外，对免疫细胞的调节作用是否受损目前则尚未明确。因此本研究旨在观察瘦素诱导产生的衰老MSC其免疫调节作用是否受到影响，为阐述SLE的发病机制提供新的依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验试剂 培养基(DMEM/F12、1640)、青/链霉素(Penicillin/Streptomycin)、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液 (PBS)(Gibco公司)；人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限公司)；重组人瘦素(Peprotech公司)；流式标记抗体(CD4、CD25、Foxp3、IL-17、CD3、CD69、PD-1、CXCR5、CD19)(BD公司)。

1.1.2实验对象 南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科2014年1月至2014年7月收住院的10例女性SLE患者，诊断符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准，均处于活动期，SLEDAI评分>6分。收集上述人群的外周血，分离出外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。脐带组织来自南京大学医学院附属鼓楼医院妇产科健康产妇，无自身免疫病病史或家族史。

1.2方法

1.2.1脐带MSC分离培养 脐带无菌采集后，于保存液中4℃保存，在24 h内处理。无菌状态下，采用无菌器械，分离剥取脐带中的华通氏胶组织，去除静脉及动脉，将胶组织剪成1 mm3的小块接种入T75培养瓶中，采用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养，置于温度37℃、5%CO2的温箱中。每3～5 d 换液1次，在倒置显微镜下观察，生长至80%融合时，采用0.25%的胰酶消化处理，收集悬浮细胞，洗涤后，按照1∶3的比例传代接种，扩增，备用。在每次细胞传代时，采用台盼蓝染色计算细胞活力，要求大于95%，细胞冻存后复苏活力大于85%。干细胞纯度：流式细胞仪检测，阳性指标CD73、CD90、CD105表达率>95% ，阴性指标CD14、CD19、CD34、CD45、 HLA-DR表达率<2%。

1.2.2淋巴细胞培养及测定 MSC与PBMC以1∶10 共培养 3 d， 收集PBMC，PBS洗涤一遍，流式细胞仪测定不同的细胞亚群。Treg细胞测定：常温避光标记CD4-FITC，CD25-APC，按照BD公司human Foxp3 buffer set步骤将细胞破膜，标记Foxp3-PE抗体，流式细胞仪检测CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。Tfh细胞测定：常温避光标记CD4-FITC、CXCR5-APC、PD-1-PerCP-Cy5.5，流式细胞仪检测CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞比例。Th17细胞：加入PMA、离子霉素、BFA，在37℃ 5%CO2孵箱共刺激4～6 h，细胞表面标记CD4-FITC，固定、破膜，胞内染色IL-17-APC，流式细胞仪检测CD4+IL-17+Th17细胞比例。B淋巴细胞：常温避光表面标记CD19-PE/Cy5，流式细胞仪检测CD19+B淋巴细胞比例。

2 结果

2.1瘦素预处理MSC对Treg细胞调节作用的影响 体外以重组人瘦素(100 ng/ml)加入MSC培养基(DMEM/F12+10%FBS)培养3 d，然后弃培养液再与SLE患者PBMC(1∶10)共培养3 d。结果发现脐带MSC上调Treg细胞比例[(8.53±2.33) % vs (5.96±1.22)%，P<0.01]，与未处理组相比较，瘦素预处理的MSCs上调Treg细胞的能力下降[(6.79±2.14)% vs (8.53±2.33)%，P<0.01]，如图1。通过共培养瘦素预处理的MSC与PBMC，发现瘦素预处理MSC使其上调Treg细胞的能力明显受损。

图1 瘦素预处理MSC前后对Treg细胞调节作用的影响Fig.1 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Treg cells(±s)Note:**.P<0.01.

图2 瘦素预处理MSC对其调节Th17细胞的影响Fig.2 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Th17 cellsNote:**.P<0.01.

图3 瘦素预处理MSC对其调节Tfh细胞的影响Fig.3 Effects of MSC treated with or without leptin on frequency of Tfh cellsNote:***.P<0.001;ns.P>0.05.

GroupsCD3+TcellCD25MFICD69MFICD19+BcellCD25MFICD69MFIPBMC12 06±4 6212 67±4 7422 43±2 468 56±2 37MSC+PBMC9 63±3 601)11 87±4 1719 16±3 621)9 14±1 34Leptin⁃MSC+PBMC10 67±4 032)12 71±4 292)21 05±2 362)10 09±1 93

Note：PBMC.Peripheral blood monocyte cell;MSC.Mesenchymal stem cell;Leptin-MSC.MSC pretreated with leptin for 3 days;MFI.Median fluorescence intensity.1)P<0.05，compared with PBMC group;2)P<0.05,compared with MSC+PBMC group.

2.2瘦素预处理MSC对Th17细胞及Tfh细胞调节功能的影响 瘦素100 ng/ml预处理MSC 3 d后， 1∶ 10与SLE患者PBMC共培养3 d。结果发现正常脐带来源的MSC可下调Th17细胞[(1.28±0.70)% vs (2.01±0.72)%，P<0.01]、Tfh细胞[(1.48±1.36)% vs (8.80±1.94)%，P<0.001]。而与未处理组相比较，瘦素预处理的MSC对Th17细胞下调作用受到抑制[(1.64±0.55)% vs (1.28±0.70)%，P<0.01]，而Tfh细胞比例有增加的趋势[(2.08±1.52)% vs (1.48±1.36)%，P=0.051]，但差异无统计学意义，结果如图2、3所示。因此瘦素预处理MSC使其体外作用下调Th17细胞的能力受损，而本研究中对Tfh细胞调节能力改变无统计学差异，可增加样本量进一步明确。

2.3瘦素预处理干扰MSC对SLE患者B淋巴细胞的调节作用 重组人瘦素100 ng/ml加入MSC培养基预处理3 d，弃上清，再以1∶10与PBMC共培养3 d。结果检测可见MSC体外降低SLE患者B细胞比例[(6.78±3.38)% vs (8.40±2.57) %，P<0.05]，而瘦素预处理后使得B细胞比例较前部分升高[(7.37±3.56)% vs (6.78±3.38)%，P<0.05]。说明瘦素预处理MSC可损伤其对B细胞的调节作用，但对其亚群(如调节性B细胞、浆细胞等)作用如何仍需进一步研究。

2.4瘦素预处理的MSC对T、B淋巴细胞活性的影响 MSC对免疫细胞的调节作用，除了细胞比例、功能外，还与细胞活性密切相关。本研究瘦素(100 ng/ml)预处理MSC与PBMC(1∶10)共培养3 d，检测CD25、CD69代表T、B淋巴细胞活性。MSC降低CD3+T细胞表面CD25荧光强度[(9.63±3.60) vs (12.06±4.62)，P<0.05]，而对CD69的表达无明显改变[ (11.87±4.17) vs (12.67±4.74)，P>0.05]。与单独MSC组相比，瘦素作用可部分上调MSC对T细胞活化分子CD25、CD69荧光强度[CD25 (10.67±4.03) vs (9.63±3.60)，P<0.05；CD69 (12.71±4.29) vs (11.87±4.17)，P<0.05]。而在B淋巴细胞活化方面，MSC下调CD19+B细胞表面CD25荧光强度[(19.16±3.62) vs (22.43±2.46)，P<0.05]，瘦素处理后CD25表达强度较前有增加[(21.05±2.36) vs (19.16±3.62)，P<0.05]。瘦素处理前后MSC对B细胞表面CD69的影响差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。故MSC体外可抑制T、B淋巴细胞活化，而瘦素则一定程度损伤了MSC对免疫细胞活化的调节能力。

3 讨论

SLE是全身性免疫性疾病，表现为免疫细胞过度活化、促炎因子增加，炎症细胞及因子在组织器官浸润，导致多脏器功能受损。目前临床治疗仍以激素、免疫抑制剂治疗为主，近年来CD20单抗、BAFF单抗等靶向药物逐渐应用于临床。

瘦素不仅参与代谢，还参与了免疫及炎症反应，尤其在狼疮疾病方面的作用得到了广泛关注[12]。动物实验发现瘦素可导致狼疮鼠自身抗体的产生、蛋白尿增多、肾脏病理加剧，而中和阻断瘦素则明显延长小鼠存活时间[13]，且瘦素缺乏则可增加Treg细胞、降低Th17细胞，并逆转狼疮鼠病情[14,15]。我们亦证实瘦素在狼疮患者及动物模型中显著增高，因此瘦素在狼疮发病及其发生发展过程中的作用值得我们深入探讨。

MSC是一种多潜能细胞，具有多向分化潜能，且表达CD105、CD90、CD73，缺乏造血细胞标记。MSC表达主要组织相容复合物(MHC)Ⅰ类分子，而不表达MHCⅡ类分子及共刺激分子(CD40、CD80、CD86)，这决定了MSC的低免疫原性。MSC具备免疫调节作用，其通过可溶性细胞因子或细胞间接触等方式，能够抑制T细胞增殖、DC细胞分化、Treg细胞数量及功能以及B细胞增殖等。临床研究发现骨髓或脐带来源MSC移植治疗SLE患者或狼疮鼠模型能够获得良好的疗效[16]。我们前期研究证实了SLE患者自身骨髓来源MSC多种异常，主要表现为异常衰老、凋亡[8]，其对T、B淋巴细胞的免疫调节亦明显受损[9]。此外，SLE患者血清已证实可加剧MSC的衰老，而在此过程中瘦素起至关重要的作用[11]。本研究则在异常升高的瘦素促进MSC细胞衰老的同时，发现其预处理MSC对免疫细胞数量及活化的调控功能亦受明显受损。

国内外研究均表明SLE患者循环Treg细胞减少，Foxp3表达降低，不能有效抑制效应T细胞的增殖及细胞因子分泌[17]；而Th17细胞增多，在组织器官聚集浸润，产生大量IL-17，进而导致组织损伤[18]；同时，Tfh细胞数量增加，促进B细胞过度活化，生发中心生成及自身抗体的异常增加，从而导致狼疮发病[19]。MSC则可通过细胞间接触及分泌可溶性细胞因子(如吲哚胺2，3双加氧酶、转化生长因子-β、白介素-10、前列腺素E2、肝细胞生长因子、人类白细胞抗原G5、一氧化氮等)的方式，增强Treg细胞免疫抑制功能[20]、抑制Th17细胞[21]及Tfh细胞的促炎作用[22]。而本研究则发现瘦素预处理明显损伤MSC对Treg细胞、Tfh细胞的免疫调控作用。瘦素作用的MSC对Tfh细胞抑制作用受到一定程度影响，但差异无明显统计学意义，可能与研究例数偏少有关，可增加样本量进一步探讨。

B淋巴细胞在SLE疾病发生发展中的作用尤其关键，主要表现为异常活化及产生自身抗体异常增多[23]。本研究发现MSC可下调B淋巴细胞比例、抑制其免疫活性，瘦素作用后MSC调节B细胞、抑制其活化等能力均减弱。与此同时，国内研究者亦发现SLE血浆培养条件可负性调控MSC对B细胞比例、增殖、成熟的抑制作用[24]。虽然Crop等提出某些炎症细胞因子可增强MSC免疫抑制功能，如干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白介素-1a/b等[25]，这可能导致上述促炎因子靶向阻断后狼疮鼠自体骨髓MSC功能受损，进而影响疗效；然而体外如以上述因子预处理MSC，再输注治疗狼疮可能一定程度上增强其免疫抑制作用。本研究首次发现瘦素在体外环境中作用可损伤MSC对免疫细胞的调控能力，此外，瘦素已有报道可直接作用于多种免疫细胞促进其免疫活化，因此我们认为靶向阻断瘦素可能成为SLE患者潜在的有效治疗方法，然而其疗效及安全性如何、对B细胞抗体分泌及调节性B细胞作用、相关信号及分子机制等有待进一步研究阐明。

综上，瘦素不仅促进MSC细胞衰老，还损伤其对免疫细胞的调控作用，故瘦素可能通过加剧MSC衰老、损伤其免疫调节功能而加重狼疮病情，为阐明SLE发病机制及可能的治疗靶点提供新的理论依据。

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