番茄CIPK基因家族鉴定及生物信息学分析

王傲雪，刘思源

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030）

钙离子作为第二信使，广泛参与植物生长发育过程并调控外界环境胁迫刺激反应[1]。细胞质中钙离子浓度瞬时升高可能因生理过程所致，包括非生物胁迫刺激（如高温、低温、盐、干旱或渗透胁迫）、病原防御、离子平衡、生长发育等[2-3]，改变细胞内钙离子时空分布[4]。植物对钙信号解码首先从钙离子感受器开始，特异刺激产生钙信号可被特异钙离子感受器感知，CBL是植物中一种钙离子感受器，可与CIPK特异互作，将钙信号传递，在植物中产生理化反应[5]。

Veronica等和Lee等分析拟南芥CIPK蛋白结构发现，拟南芥CIPK蛋白均在N端包含激酶结构域，C端包含调节结构域，其中C端调节域包括NAF结构域（与CBL蛋白特异结合）和PPI结构域（与PP2C互作）[6-7]。在无CBL蛋白结合情况下，CIPK蛋白无激酶活性，因CIPK的C端调节域抑制N端激酶域。一旦CIPK蛋白与CBL蛋白结合，CIPK C端调节域移动使激酶域显露而活化[8]。

近年来，植物中发现CBL-CIPK参与高盐、低温、干旱、营养元素、氧化胁迫、高Ph胁迫、激素信号应答等多种环境因素刺激引发的生理变化。其中CBL-CIPK参与盐胁迫SOS途径主要包括SOS1（Na+/H+antipoter）、SOS2（AtCIPK24）、SOS3（AtCBL4）3个功能蛋白，在高盐环境下SOS2和SOS3结合并磷酸化激活SOS1，SOS1从细胞质吸收质子排除钠，维持细胞内低盐环境[9]。除此，其他非生物胁迫过程中CIPK基因也发挥重要作用，拟南芥中AtCBL9-AtCIPK3和AtCBL1-AtCIPK7信号通路参与低温诱导调控[10-11]；水稻中OsCIPK3可被低温诱导，上调表达[12]；小麦中TaCBL4、TaCBL9、TaCIPK7、TaCIPK15、TaCIPK24、TaCIPK32参与诱导植物低温胁迫应答[13]。Yong等通过表达拟南芥CBL5基因提高其干旱胁迫抗性[14]；水稻中过表达OsCIPK12后可增强其耐旱性[12]。

番茄随基因组公布已鉴定YABBY、bZIP、GRF等功能基因家族[15-17]，但CIPK蛋白家族尚未报道。本研究基于番茄全基因组数据、拟南芥CIPK基因家族氨基酸序列及生物信息学常用软件，在全基因组范围内，鉴定番茄CIPK基因家族成员序列并预测生物信息学信息及作用，为揭示该家族成员生物学功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 番茄CIPK基因家族的鉴定及生物信息学分析

利用现有番茄注释基因的核苷酸序列（https://solgenomics.net/）与拟南芥CIPK氨基酸序列（https://www.arabidopsis.org/）作tBLASTn比对（E-value＜1e-10,identity＞50%），去除重复，筛选CIPK候选基因。利用Prosite网站（http://prosite.expasy.org/）鉴定候选CIPK蛋白结构域，挑选同时具有NAF和PPI结构域蛋白序列。鉴定番茄CIPK基因家族成员后用ExPASy Proteomics Sever网站（http://expasy.org/）预测所有番茄CIPK蛋白氨基酸序列蛋白质长度、分子质量、等电点。

1.2 番茄CIPK基因家族系统进化分析

为探究CIPK基因家族内进化关系，用MEGA软件，采用邻接法（Neighbor-Joining），将番茄、拟南芥、杨树、小麦、水稻、加拿大油菜CIPK基因家族分析合并系统进化，校验参数 1 000次重复。

1.3 番茄CIPKs基因结构分析

提取番茄CIPK基因CDS序列及对应基因组序列信息，运用GSDS工具分析基因结构，绘制番茄CIPK基因家族外显子-内含子结构图。

1.4 番茄CIPK基因家族顺式作用元件分析

分析启动子区域的顺式作用元件，用 UGENE软件从基因组序列中获取起始密码子上游1 500 bp基因序列，plantCARE软件（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）搜索顺式作用原件，确定启动子区域包含顺势作用元件。

1.5 番茄CBL、CIPK基因家族相互作用分析

以STRING软件（http://string-db.org/）分析番茄13个SlCBLs和22个SlCIPKs相互作用[18]，保留可信度大于0.700相互作用关系，隐藏无相互作用蛋白。

1.6 番茄低温转录组数据中番茄CIPK表达量分析

以Reads Per Kilobase per Million mapped reads（RPKM）分析基因表达水平。计算番茄低温（4℃）胁迫下CIPK基因家族表达量，Heml绘制热图。

2 结果与分析

2.1 番茄CIPK基因家族的鉴定及生物信息学分析

经生物信息学分析，鉴定番茄中22个SlCIPK基因家族成员，除10号染色体外均有分布，其中五号染色体上分布成员最多。番茄CIPK基因家族成员氨基酸长度差异较小，变化范围为419 aa（SlCIPK14）～478 aa（SlCIPK11、SlCIPK3）。番茄CIPK成员等电点变化范围为6.21（SlCIPK22）～9.21（SlCIPK5）。在番茄CIPK基因家族中分子质量最小成员为SlCIPK15（47.6 ku），最大为SlCIPK6（57.8 ku）（见表1）。

表1 番茄CIPK基因家族特征分析Table 1 Character of tomato CIPK genes

2.2 番茄CIPK基因系统进化分析

通过番茄、拟南芥、杨树、小麦、水稻、加拿大油菜组成系统进化树分析，CIPKs可分为A、B、C、D、E、F、G、H八个亚组，其中A亚组包 含 SlCIPK17、 SlCIPK14、 SlCIPK12， SlCIPK17与PtCIPK21为垂直同源基因对，SlCIPK14、SlCIPK12为平行同源基因对；B亚组中包含SlCIPK18和SlCIPK5，二者为平行同源基因对；C亚组中仅包含SlCIPK3；D亚组中包括SlCIPK16和SlCIPK13；E 亚组中 包 含 SlCIPK11、 SlCIPK9、SlCIPK4和SlCIPK6，SlCIPK4和SlCIPK6为平行同源基因对；F亚组包括SlCIPK15和SlCIPK21，二者为平行同源基因对；G亚组中的SlCIPK10和SlCIPK22也为平行同源基因对；H亚组中成员最多，番茄CIPK家族成员数量最多，包括：SlCIPK20、 SlCIPK7、 SlCIPK2、 SlCIPK8、 SlCIPK1和SlCIPK19，SlCIPK1和SlCIPK19为平行同源基因对（见图1）。

图1 CIPK家族进化树分析Fig.1 Unrooted neighborjoining phylogenetic tree of CIPK genes

图2 番茄CIPK基因外显子-内含子结构分析Fig.2 Exon-intron structure of tomato CIPK genes

2.3 番茄CIPK基因结构分析

由图2可知，番茄CIPK基因家族分为内含子富集和内含子缺失两类，其中SlCIPK9、SlCIPK11、SlCIPK15、SlCIPK21、SlCIPK13、SlCIPK16、SlCIPK3、SlCIPK17、SlCIPK5、SlCIPK18 无内含子；SlCIPK4、SlCIPK6、SlCIPK12仅1个内含子，以上成员均属于内含子缺失组；SlCIPK1、SlCIPK2、SlCIPK8含14个内含子，SlCIPK7、SlCIPK20含13个内含子，SlCIPK10、SlCIPK22含11个内含子，以上成员均属多内含子富集组。

2.4 番茄CIPK基因家族顺式作用原件分析

番茄CIPK基因家族成员上游1 500 bp存在多个与植物逆境应答相关顺式作用原件，其中77%（17/22）成员具有TC-richment顺式作用原件，说明大多数成员均与防卫和逆境应答相关；68%（15/22）成员具有HSE作用原件，说明与响应热胁迫相关；36%（8/22）成员具有LTR顺式作用原件，说明可能与冷胁迫应答相关；36%（8/22）成员具有茉莉酸甲酯应答元件；36%（8/22）成员具有BOX-W1原件说明这些基因在真菌侵染后可能发挥作用，且具BOX-W1原件的CIPK成员均有w-box原件；7个CIPK家族成员存在ABRE原件，说明32%成员可能与脱落酸应答相关；7个CIPK家族成员存在MBS原件，说明32%成员与干旱胁迫相关；仅4个基因具有TCA原件，可能与水杨酸应答相关（见表2）。

表2 番茄CIPK顺式作用元件分析Table2 Cis-elementsanalysis of tomato CIPK genes

2.5 番茄CBL、CIPK基因家族相互作用分析

由图3可知，SlCBLs与SlCIPKs间互作关系复杂，但并非所有SlCIPK和SlCBL成员参与，预测SlCIPK2、 SlCIPK14、 SlCIPK3、 SlCIPK15、SlCIPK18、 SlCIPK19、 SlCIPK11、 SlCIPK21、SlCIPK17、 SlCIPK8、 SlCIPK10、 SlCIPK12 参与CBL-CIPK互作。番茄某一CIPK蛋白可结合一个或多个CBL蛋白，同时某一CBL蛋白也可与一个或多个CIPK蛋白相互作用。

图3 SlCBLs-SlCIPKs相互作用网络Fig.3 SlCBLs-SlCIPKs interaction network

图4 番茄CIPK基因表达分析Fig.4 Expression analyses of tomato CIPK genes

2.6 番茄低温转录组数据中CIPK表达量分析

结果见图4。

由图 4可知，SlCIPK1、SlCIPK2、SlCIPK15、SlCIPK14、SlCIPK21、 SlCIPK3、 SlCIPK9、SlCIPK10、SlCIPK7、SlCIPK18、SlCIPK12、SlCIPK22 冷诱导12 h后表达量升高；SlCIPK13、SlCIPK20、SlCIPK11、SlCIPK7、SlCIPK19、SlCIPK4、SlCIPK4冷诱导后表达量几乎无变化；在番茄中SlCIPK5、SlCIPK6、SlCIPK8、SlCIPK16表达量较低。

3 讨论与结论

本研究利用生物信息学方法从番茄中鉴定22个SlCIPK基因。目前，已在多种植物中发现CIPK基因：刘淑梅等在加拿大油菜中鉴定出26个BnaCIPK26基因[18]；Hanfeng等在杨树中发现27个PtCIPK基因[19]；Yanhua等在小麦中鉴定出32个TaCIPK基因[20]；Ting等在茄子中发现25个SmCIPK基因[21]。番茄除10号染色体外均有SlCIPK分布，氨基酸长度变化范围419～478 aa，等电点变化范围6.21～9.21，分子质量变化范围47.6～57.8 ku。由番茄、拟南芥、杨树、小麦、大米及加拿大油菜CIPK成员构建系统进化树可分为A、B、C、D、E、F、G、H八个亚组且每个亚组中均有SlCIPK分布，其中 SlCIPK12 与 SlCIPK14、 SlCIPK18 与 SlCIPK5、SlCIPK4与SlCIPK6、SlCIPK15与SlCIPK21、SlCIPK10与SlCIPK22、SlCIPK1与SlCIPK19为平行同源基因对；SlCIPK17与PtCIPK21为垂直同源基因对。SlCIPKs分为内含子富集组和内含子缺失组，与木薯 MeCIPK基因中发现一致[22]。根据基因序列内含子情况，拟南芥CIPK基因家族分为两个分支，第一种不含内含子或仅含有1个内含子，第二种CIPK蛋白激酶含有9个或以上内含子。不含内含子或仅含1个内含子CIPK基因系统发生于含9个或以上内含子基因之后，可能是第二类含9个或以上内含子基因mRNA反转录过程中，重新插入基因组而出现分支[23]。通过蛋白相互作用预测发现，1个SlCBL蛋白可与1个或者多个SlCIPK蛋白相互作用。同样，1个SlCIPK蛋白也可与1个或多个SlCBL相互作用，与木薯和辣椒中发现一致[22,24]。通过冷胁迫下转录组数据分析发现，番茄CIPK基因家族中多个成员受冷胁迫后表达量发生变化。拟南芥中AtCBL9-AtCIPK3和AtCBL1-AtCIPK7参与低温诱导调控，其中AtCIPK3基因可能通过调控CBF/DREB1转录因子基因调节抗冷基因表达[10-11]。本研究通过一系列生物信息学分析，为深入研究番茄 CIPK基因家族功能奠定基础，有待后续研究验证番茄CIPK基因家族生物学功能。

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