番茄颈腐根腐病菌分离鉴定与生物学特性研究

李景富，孙亚莉，赵婷婷，姜景彬，许向阳

（东北农业大学园艺园林学院，哈尔滨 150030）

番茄为全球主要种植蔬菜之一，但病害种类较多，发病严重，降低品质及产量。番茄颈腐根腐病，俗称“死棵病”，常见于我国山东省番茄连作大棚。分离鉴定大棚病株发现，番茄颈腐病致病菌为尖孢镰刀菌。耿丽华等在2007年鉴定出北京郊区大棚番茄病害为颈腐根腐病，病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐专化型，并分析病原菌菌丝生长和孢子萌发温度、pH、氮源[1]。国外对番茄颈腐病相关研究较多[2-4]。番茄颈腐根腐病已发展为破坏性极大土传病害之一，侵染后造成减产70%～83%[5]。幼苗感病初期出现老叶变黄和小叶萎缩，病原菌攻击根部和基部，使其褐变和腐烂，晚期症状表现为茎基部萎缩倒塌，根腐烂，甚至死亡[6-7]，成熟植株感染表现为果成熟前期老叶边缘黄化，茎基部有明显深褐色病斑，植株纵向截面后，根茎皮层可见广布褐变斑点和腐烂现象，褐变不超过土壤线25～30 cm[8]。一些生物防治剂可有效控制温室内番茄颈腐根腐病，配合使用效果良好[9]。研究表明，选育抗病品种和选用抗性砧木嫁接栽培为最有效防治方法[10]，用植物代谢物和基于植物衍生处理方法抑制颈腐根腐病，可替代某些化学物质杀菌剂如恶霉灵和苯菌灵[11-12]。

目前鲜见番茄颈腐根腐病病原菌产孢条件、致病性、生理小种研究，急需筛选有效抗病生物制剂和抗病种质资源。文章结合传统病原菌形态观察、柯赫氏证病法及rDNA-ITS序列分析方法，对番茄颈腐根腐病作病原菌鉴定，探究病菌菌丝和产孢适宜条件等基本生物学特性，为识别鉴定该病害及抗病种质资源筛选等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

番茄品种：Moneymaker，由东北农业大学番茄研究所提供。

1.2 供试培养基

①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g，葡萄糖15～20 g，琼脂粉17～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH为7[13]。②燕麦培养基：燕麦片30 g，琼脂粉17～20 g，蒸馏水1 000 mL[14]。③ 番茄秧汁培养基：番茄叶300 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，蒸馏水1 000 mL[15]。④查彼克培养基：KNO32.00 g，KCl 0.50 g，FeSO40.01 g，MgSO4· 7H2O0.50 g，Na2HPO41.00 g，蔗糖30 g，蒸馏水1 000 mL[14]。⑤琼脂糖培养基：葡萄糖15～20 g，琼脂粉17～20 g，蒸馏水1 000 mL[13]。

1.3 病原菌分离鉴定

1.3.1 病原菌采集

2017年4月4日、4月26日，5月14日共3次从山东温室大棚采回病株并编号，观察植株下部叶片变黄萎蔫，茎基部有成片褐色斑点并缢缩，根部部分腐烂，将茎基部横切发现韧皮部部分变褐。

1.3.2 病原菌分离

将病株茎基部感病组织和根部缢缩部分剪成小段，参考文献[13]常规组织分离法，根据实际分离情况稍加改动[13]，75%酒精消毒30 s，1%升汞溶液消毒1.5 min，无菌水漂洗3次后接种至PDA培养基，25℃恒温培养。每日观察病菌生长情况。

1.3.3 病原菌纯化

从平板长出的菌落边缘挑菌丝至新PDA培养基，直至菌落均一，采用涂板纯化法，挑针挑取少许菌丝于10 mL ddH2O中摇2 min制成孢子悬液，稀释成不同浓度，灭菌枪头吸取稀释后菌液两滴于PDA平板培养基中央，消毒涂布棒将菌液均匀涂至培养基，25℃恒温培养，每日观察病菌生长情况。

1.3.4 病原菌鉴定

1.3.4.1 病原菌形态鉴定

观察25℃恒温箱中培养10 d菌落质地、形状、颜色，测量分生孢子尺寸，孢子梗长度。

1.3.4.2 分子生物学鉴定

病原菌DNA提取采取CTAB法，PCR扩增采用真菌核糖体DNA转录间隔区通用引物：

ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；

ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

反应体系为H2O 17.8μL，Buffer 3μL，dNTP 2μL，Primer1 3μL，Primer2 3μL，DNA 模板1μL，酶0.2μL，反应总体积30μL。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，结果在GenBank数据库中对比。

1.3.4.3 柯赫氏证病法

用打孔器在菌落边缘取直径6 mm菌饼4片，放入装有150 mL PD液体培养基三角瓶中，150 r·min-1，28℃摇4 d，用无菌水将培养液稀释为浓度1.0 ×106个·mL-1孢子悬浮液。

番茄种子用75%酒精浸泡20 s，灭菌水清洗3次，待种子晾干后在温室大棚中播种于育苗盘，四叶一心时采用棉球接种法和浸根法反接[16]，PD液体培养基代替孢子悬浮液作对照，其他处理相同，每日喷雾保湿，发病时采集分离纯化病原菌测序鉴定。

1.3.5 病原菌保存

保存以上鉴定为番茄颈腐根腐病病原菌菌株，将菌株接种至PDA试管培养基，室温下培养3～4 d，4℃冰箱中冷藏保存。为维持病原菌致病力，每3个月作一次继代培养重新保存[17]。

1.4 病原菌生物学特性研究

1.4.1 高温致死情况研究

菌株培养在25℃恒温箱中，采用PDA培养基，待菌落生长10 d左右时，用直径6 mm打孔器在菌落边缘取圆形菌片置于装有10 mL灭菌水试管，恒温水浴[18]，温度设置为56、57、58、59、60、61、62、63、64、65℃，3次重复，1 h后挑取菌块于PDA培养基中，25℃恒温培养3 d后每日观察菌株生长情况，确定致死温度。

1.4.2 不同温度对菌丝生长影响

25℃恒温箱中菌株培养，采用PDA培养基，待菌落生长10 d用直径6 mm打孔器在菌落边缘取菌落一致圆形菌片，置于新PDA平板中央，温度设置为20、23、25、28、30、35 ℃，pH为7，5次重复，每48 h用十字交叉法测定一次菌落直径，第6天确定菌丝生长最适温度[8]。

1.4.3 不同光照对菌丝生长影响

光照设置为24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照，温度为最适温度，其余操作同1.4.2，记录数据并分析。

1.4.4 不同PH对菌丝生长影响

处理培养基的pH分别调整为5、6、7、8、9、10、11、12，温度为最适温度，其余操作同

1.4.2 ，记录数据并分析。

1.4.5 不同培养基对菌丝生长影响

处理培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦培养基、查彼克培养基、番茄秧汁（寄主）培养基、琼脂糖培养基，其余操作同

1.4.2 ，记录数据并分析。

1.4.6 不同碳源对菌丝生长影响

将PDA培养基作为基础培养基，碳源为葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、麦芽糖，用不同碳源等量替换葡萄糖并作缺碳对照，其余操作同1.4.2，记录数据并分析。

1.4.7 不同氮源对菌丝生长影响

参照韩文华等方法[19]，将PDA培养基作为基础培养基，氮源为硫酸铵、尿素、甘氨酸、氯化铵、乙酸铵，按PDA培养基配方另外再加0.5%氮源并作缺氮对照，其余操作同1.4.2，记录数据并分析。

1.4.8 不同温度对产孢影响

用直径6 mm打孔器在培养10 d左右菌落边缘打取菌落一致圆形菌片，置于新PDA平板中央，温度设置为20、23、25、28、30、35℃，pH为7，3次重复，10 d后测量产孢量，参照康立功等方法将20 mL无菌水注入待测培养皿中，冲洗孢子和菌丝，磁力振荡器振荡几分钟使孢子完全释放，过滤制成孢子悬浮液，吸取一定量孢子悬浮液滴至血球计数板，显微镜观察计数分析[20]。

1.4.9 不同光照对产孢影响

光照设置为24 h黑暗、12 h光照12 h黑暗、24 h光照，温度为最适温度，其余操作同1.4.8。

1.4.10 不同pH对产孢影响

培养基pH分别调整为5、6、7、8、9、10、11、12，温度为最适温度，其余操作同1.4.8。

1.4.11 不同培养基对产孢影响

培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、燕麦培养基、查彼克培养基、番茄秧汁（寄主）培养基、琼脂糖培养基，温度为最适温度，其余操作同1.4.8。

1.4.12 不同碳源对产孢影响

将PDA培养基作为基础培养基，碳源为葡萄糖、乳糖、木糖、蔗糖、麦芽糖，用不同碳源等量替换葡萄糖并作缺碳对照，温度为最适温度，其余操作同1.4.8。

1.4.13 不同氮源对产孢影响

PDA培养基作为基础培养基，氮源为硫酸铵、尿素、甘氨酸、氯化铵、乙酸铵，按PDA培养基配方另加0.5%氮源并作缺氮对照，温度为最适温度，其余操作同1.4.8。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定结果

2.1.1 病原菌分离纯化结果

分离3 d后平板中生长白色绒状菌丝如图1所示，显微镜初步鉴定为镰刀菌。涂板分离时将菌悬液继续稀释100倍单菌落较分散，效果良好，获生长均匀单一菌株。

图1 组织分离3 d后菌丝生长情况Fig.1 Mycelial growth after 3 d of tissueisolation

2.1.2 病原菌鉴定结果

2.1.2.1 病原菌生长形态鉴定结果

如图2所示，纯化获单一菌株生长较一致，菌落平铺生长，细绒毛状为圆形，淡紫红色。分生孢子较多，含质体，略透明，基本无格，长宽比2.3～6，大分生孢子两头稍尖，微弯，长度约20～25μm，小型分生孢子多为椭圆或纺锤形，长度约4～8μm。厚垣孢子为透明状球形，顶生或间生。孢子梗长度较短，生长于菌丝侧面，无分枝。根据形态特征初步鉴定为尖孢镰刀菌（见图3～4）。

2.1.2.2 分子生物学鉴定

由图5所示，目的条带约550 bp，拼接结果为542 bp，将序列上传基因库中得序列登录号为MG736729，根据在基因库中Blast结果，该病菌与尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum亲源关系最近。

图2 病原菌生长5 d形态Fig.2 Pathogen morphology after 5 d

图3 大孢子和小孢子Fig.3 Megasporesand microspores

图4 厚垣孢子和孢子梗Fig.4 Cryptosporidium and sporestem

2.1.2.3 柯赫氏证病法

由图6所示，棉球接种幼苗5 d后发现茎基部有褐色腐烂，甚至发生倾倒，传统浸根方法接种幼苗发病较晚，症状表现为茎部有褐色条状凹痕，缢缩，下部叶片变黄，有气生根。对发病植株作病原菌基因组DNA提取，PCR扩增，送北京六合华大基因科技有限公司测序，发现与接种病原菌分子生物学鉴定结果一致，证明试验分离病菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型。

2.2 生物学特性

2.2.1 高温致死情况

将菌块转移至新PDA培养基生长3 d后发现56、57、58、59、60℃处理菌块均生长菌丝，61、62℃处理菌块部分生长菌丝，其余处理无变化，一周后63、64、65℃处理菌块仍未生长菌丝，证明致死温度为63℃，1 h。

图5 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物Fig.5 PCR product detected by agarosegel electrophoresis

图6 人工接种病原菌发病情况Fig.6 Symptomsof artificial inoculation

2.2.2 不同温度、光照、pH对菌丝生长影响

由表1可知，病原菌在20～35℃范围均可生长，28℃时菌落直径最大，说明菌丝生长最快，与其他温度处理相比差异均达极显著水平，说明28℃为该病原菌生长最适温度。

对于光照情况，病原菌在不同光照情况下均可生长，光暗交替时菌落直径最大，说明菌丝生长最快，且处理12 h光照12 h黑暗与处理24 h黑暗相比差异显著，与处理24 h光照相比差异达极显著水平，说明光暗交替12 h有利于病原菌菌丝生长。

对于不同pH情况，病原菌在pH 5～12均可生长，pH=9时菌落直径最大说明菌丝生长最快，pH=9与pH=10相比差异不显著，与pH=11、12相比差异显著，与处理pH=8、7、6、5相比差异极显著，说明病原菌菌丝在偏碱性条件下生长较好，酸性条件不利生长，pH=9有利菌丝生长。

2.2.3 不同培养基、碳源、氮源对菌丝生长影响

由表2可知，病原菌在5种培养基上均可生长，燕麦培养基上菌落直径最大，说明菌丝生长最快，其中琼脂糖培养基、查彼克培养基、PDA培养基间无差异，燕麦培养基与其他处理相比差异极显著，说明燕麦培养基利于病原菌菌丝生长。

对于不同碳源，病原菌在各处理培养基均可生长，以乳糖为碳源培养基菌落直径最大，说明菌丝生长最快，碳源乳糖和麦芽糖与缺碳对照相比差异不显著，其他碳源与对照相比差异极显著，添加不同碳源不利于病原菌菌丝生长，乳糖最利于促进菌丝生长。

表1 不同温度、光照、p H菌丝生长差异显著性测验Table1 Significant test of differencein mycelial growth on different temperature,light and p H

对于不同氮源，病原菌各处理培养基均可生长，以甘氨酸为氮源培养基上菌落直径最大，菌丝生长最快，且与对照相比差异极显著，说明甘氨酸有利于病原菌菌丝生长。以氯化铵、硫酸铵为氮源培养基与对照相比差异极显著且菌落直径小于对照，不利于病原菌菌丝生长。

2.2.4 不同温度、光照、pH对产孢影响

由表3可知，病原菌各处理温度下均可产孢，25℃时产孢量最大，与28℃相比差异不显著，与30、23、20℃相比差异显著但未达极显著水平，与35℃相比差异极显著，说明25和28℃利于病原菌产孢。

对于不同光照，病原菌在各处理光照情况下均可产孢，24 h黑暗时产孢量最大，与24 h光照产孢量相比差异不显著，与12 h光照12 h黑暗相比差异显著，说明间断光照不利于病原菌产孢，持续黑暗条件可促进病原菌产孢。

对于不同pH，病原菌在pH 5～12培养基上均可产孢，pH=8时产孢量最大，与处理pH=6和pH=7相比差异显著，与其他处理相比差异不显著，说明不同pH对病原菌的产孢影响不大，偏碱性条件相对适宜病原菌产孢。

2.2.5 不同培养基、碳源、氮源对产孢影响

由表4可知，病原菌在5种培养基上均可产孢，PDA培养基上产孢量最大，与番茄秧汁培养基相比差异不显著，与琼脂糖培养基相比差异极显著，与其他处理相比差异显著，说明供试培养

基PDA最利于病原菌产孢。

表2 不同培养基、碳源、氮源的菌丝生长差异显著性测验Table2 Significant test of differencein mycelial growth on different medium,carbon sourceand nitrogen source

表3 不同温度、光照、p H的产孢差异显著性测验Table3 Significant test of differencein sporulation on different temperature,light and pH

对于不同碳源，病原菌在各供试碳源培养基均可产孢，葡萄糖碳源培养基上产孢量最大，与木糖相比差异显著，与其他处理相比差异不显著，说明不同碳源对病原菌产孢影响不大，木糖不利于病原菌产孢。

对于不同氮源，病原菌在各供试氮源培养基上均可产孢，以PDA（对照）培养基上产孢量最大，供试氮源和对照相比差异不显著，说明不同氮源对病原菌产孢基本无影响。

表4 不同培养基、碳源、氮源的产孢差异显著性测验Table4 Significant test of differencein sporulation on different medium,carbon sourceand nitrogen source

3 讨论与结论

文章结合多种方法鉴定山东温室大棚大面积番茄植株茎部病害，证明其为番茄土传病害颈腐根腐病，病原菌为尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型（Fusarium oxysporum f.sp.radicis-lycopersici），与程琳等研究结果一致[21]。形态学结合分子生物学方法及人工接种验证鉴定结果真实可靠。病原菌生物学特性研究对掌握该病害发生规律，选育抗病种质资源有重要作用，本试验研究病原菌菌丝生长和产孢所需营养和环境条件，确定菌丝生长最适温度为28℃，与Benaouali等研究一致[6]，产孢最适温度为25℃，耿丽华研究认为菌丝生长和孢子萌发最适温度均为25℃，产孢和孢子萌发最适温度一致。综上说明，该病原菌生长最适温25～28℃[1]。菌丝生长最适pH为9，产孢pH为8，与Rattink研究结果一致[22]，表明病原菌适于偏碱性条件下生长，我国北方土壤偏碱性，病害爆发严重。研究证明光暗交替12 h有利于菌丝生长，24 h黑暗有利于病原菌产孢，真菌一般黑暗条件利于产孢[23]。菌丝生长最适培养基为燕麦培养基，碳源为乳糖，氮源为甘氨酸即有机氮，铵态氮和尿素不利于菌丝生长，与耿丽华等研究结果一致[1]。Farooq等认为葡萄糖是该病原菌最合适碳源[24]，结果差异可能因所选碳源种类不同造成，后者并未明确选择乳糖作碳源，也可能是病原菌培养条件差异造成。但Farooq等研究结果与本文病原菌产孢适宜条件一致，产孢最适培养基为PDA培养基，碳源为葡萄糖[24]。综上说明病原菌菌丝生长和产孢条件相关性不大，研究应兼顾考虑这两个因素。

番茄颈腐根腐病致病菌除侵染番茄外，还危害葫芦科豆科和藜科植物[25]，尖孢镰刀菌番茄颈腐根腐病专化型危害更大，应引起研究者足够重视并开发有效生物防治方法。目前认为选育抗病品种和砧木嫁接防治效果最佳[12]，已筛选抗病种质资源有效标记为与单基因Frl紧密连锁保守序列位点C2-At2g38025所设计的CAPS标记C2-25[26]，程琳等运用此方法鉴定田间25份种质材料[21]，分子标记筛选与人工接种筛选基本一致。后续试验可利用这两种方法对各种番茄品种作有效抗病资源筛选，加快选育抗病品种进程。

明确该病害及其致病菌，可为今后山东温室大棚及其他地区该番茄病害研究和防治提供依据。番茄颈腐根腐病在我国多地均有发生，本研究仅采集山东省大棚病株鉴定存在一定局限，分离菌株较单一，是否存在其他菌类共同作用仍未可知，生理小种分化尚未明确。后续研究重点为苗期接种条件筛选[27]、病原菌侵染和传播途径、生理小种分化、抗性遗传机制及抗病育种。

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