Klotho在急性肾损伤诊治中的作用进展

邱书娟，孙秀菊，李香玲

(潍坊医学院附属医院,山东潍坊 261041)

Klotho是1997年日本学者在研究自发性高血压小鼠模型时发现的一种具有抗衰老作用基因，Klotho基因缺陷小鼠衰老过程加快，过早出现皮肤萎缩、性腺功能减退、动脉粥样硬化、骨质疏松等征象[1]，因此以希腊神话中掌握人类生命线的女神Klotho命名。后续研究发现，Klotho基因过表达小鼠在体内Klotho浓度2倍于野生小鼠的同时平均寿命也延长20%～30%。除抗衰老作用外，Klotho还具有抗氧化、抗凋亡、保护血管及参与机体磷代谢等多种作用，且与肾脏疾病关系密切，在多种急、慢性肾脏疾病中都检测到其表达显著降低，与肾功能存在相关性，本文就近年来Klotho在急性肾损伤诊断及治疗中作用的研究进展进行如下综述。

1 Klotho的生物学活性

Klotho在体内可由肾脏、脑、甲状旁腺等多个器官分泌，以肾脏中浓度最高，主要由肾小管上皮细胞分泌[2]。除传统的Klotho外，还有两种同源异构体：β-Klotho和γ-Klotho，其中前者主要在胆汁酸和能量代谢中起作用，而后者的作用至今未明，基于此，最先发现的Klotho又被称为α-Klotho，本文中仍沿用传统名字Klotho。Klotho基因定位在人类13号染色体，其编码的蛋白产物被不同的蛋白酶剪切后分别产生膜型和分泌型两种形式。目前研究发现，膜型Klotho是骨源性激素成纤维生长因子23(FGF-23)的共受体，其与FGF-23及其受体结合形成复杂的共同体而发挥下游效应[3]，在机体的钙磷代谢及凋亡中发挥作用。而分泌型Klotho被选择性剪切后直接释放到胞外，或由膜型Klotho蛋白的胞外部分被膜锚定蛋白酶ADAM10/17剪切后释放出来，以内分泌激素的形式分布于血液、尿液及脑脊液中,其具有糖苷酶活性，能调节离子通道和转运体、抑制氧化应激、抗衰老等，又称为可溶性Klotho。

1.1 膜型Klotho 膜型Klotho作为FGF-23的共受体能增加其与受体结合物的稳定性，从而加强其生物学作用。FGF-23是调节机体磷代谢的重要物质，能抑制肾脏分泌1-α羟化酶，降低1,25-(OH)2 VitD3的产生并加速其分解，从而减少磷在肠道的吸收，在血磷的长期调节方面起重要作用。Klotho基因缺失的纯合子小鼠体内1,25-(OH)2 VitD3水平显著升高，同时1-α羟化酶表达增加[4]，而Klotho基因的正常表达能降低1-α羟化酶活性，降低1,25-(OH)2 VitD3水平的同时减少其受体的表达，表明正常的Klotho蛋白表达对维生素D的代谢平衡非常重要。FGF-23能够通过减少肾小管对磷的重吸收而增加尿磷，主要作用机制为抑制近端肾小管上皮细胞顶端膜的钠-磷协同转运蛋白Ⅱ。Klotho基因缺陷小鼠存在显著的高磷血症，而通过增强基因表达或补充外源性重组Koltho均能使小鼠的血磷恢复正常。有研究表明，Klotho基因过表达小鼠较正常鼠有较低的血磷水平，同时尿磷明显增加，提示Klotho能通过减少肾脏对磷的重吸收而降低血磷[5]。

1.2 分泌型Klotho

1.2.1 抗衰老 抗衰老作用是Klotho首先被发现的作用。Klotho在体外和体内均能明显抑制尿毒症诱导的内皮细胞衰老进程，且其水平与内皮细胞衰老程度呈负相关，对NF-κB激活的抑制被认为在其中起重要作用[6]。Klotho能降低过氧化氢和依托泊苷诱导的人脐静脉血管内皮细胞caspase3和caspase9的活性，减少衰老相关β-半乳糖苷酶表达，延缓衰老进程，p53/p21信号通路与细胞发育、细胞周期调控及细胞凋亡密切相关。Klotho能抑制p53/p21的表达,而其水平降低能增加p53/p21的表达，促进衰老进程[7]。重组Klotho能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的凋亡和衰老[8]，这种保护作用可以被丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)抑制剂减弱，推测Klotho可能通过引起MAPKs的磷酸化发挥抗凋亡和抗衰老作用。

1.2.2 抗氧化 机体内缺血、缺氧时会产生过量的活性氧，超过抗氧化系统的清除能力时会在体内大量蓄积造成细胞损伤，促进衰老过程，在糖尿病、肾病等疾病的病理发展过程中起重要作用。Klotho具有显著的抗氧化活性，能增加体外培养的人脐静脉内皮细胞cAMP产物，增强超氧化物歧化酶活性从而减轻氧化应激损伤。Klotho高表达的转基因小鼠较野生型小鼠有更高的抗氧化应激能力，寿命明显延长，可能与抑制p53、p21等与衰老和凋亡有关的基因、激活cAMP途径[6]等有关。同时，氧化应激也对Klotho蛋白的产生具有抑制作用，在急性肾损伤(AKI)、糖尿病肾病等存在明显氧化应激的疾病中均可观察到Klotho及其产物的表达降低[9]，而减少氧自由基的产生可抑制Klotho的下降，可见氧化应激与Klotho间存在着相互制约、相互影响的复杂关系。

1.2.3 抗炎症 Klotho还能抑制炎症细胞、减轻炎症反应。Klotho与内皮细胞共同培育能明显减轻其由TNF-α诱导的黏附分子增加及NF-κB系统的活化。Liu等[10]发现，细胞内Klotho无论在体内还是体外均能抑制与衰老相关的炎症因子IL-6和IL-8，其作用机制可能与维甲酸诱导基因-Ⅰ的相互作用有关。另一方面，炎症反应也能抑制Klotho的产生，炎症因子TNF-α能减少小鼠肾脏Klotho的产生，其作用机制与活化NF-κB信号通路有关，应用NF-κB抑制剂能增加Klotho的表达。Thurston等[11]在三种不同的小鼠炎症性肠病模型中均检测到Klotho基因转录及表达降低，且降低程度与肠炎的严重程度正相关，而应用抗TNF抗体可明显缓解Klotho的缺乏状态，提示炎症对Klotho存在抑制作用。

1.2.4 调节离子通道 Klotho不但能通过影响钠磷协同转运蛋白调节血磷，还对其他多种离子通道具有调节作用，如能通过调节肾脏钙离子通道瞬时感受器电位阳离子通道V5增加肾小管对钙离子的重吸收，参与调节钙平衡；通过对肾脏外髓质钾通道1的干预参与钾平衡等。Klotho在发挥调节离子通道作用时类似于酶，其胞外结构中有20%～40%的氨基酸序列与糖苷酶相同；在参与肾脏离子通道和转运体的调控时具有β-糖苷酶和唾液酸酶的活性，因此被认为是一种新的钙磷调节激素。

1.2.5 抗血管及软组织钙化 高磷血症是血管及软组织钙化的重要促进因素，Klotho的降低血磷作用使其能有效减少血管及软组织钙化水平。慢性肾脏病动物模型中Klotho高表达小鼠的异位钙化水平较野生型及Klotho基因缺陷小鼠明显降低[12]。Klotho对甲状旁腺激素(PTH)的抑制也是其减轻异位钙化的重要机制，其除了能通过对血磷、活性维生素D及FGF-23的影响对PTH进行调节外，还能直接影响PTH的产生和分泌。Ben-Dov等在甲状旁腺组织中发现了FGFR1、FGFR3，认为FGF-23在甲状旁腺中与Klotho/FGFR结合后激活MAPK级联信号通路直接调节PTH的分泌。正常表达的Klotho和FGF-23能增加甲状旁腺的钙敏感受体和维生素D受体的表达，且抑制甲状旁腺细胞增生，从而减少PTH的分泌。

2 Klotho在AKI诊治中的作用

2.1 Klotho在AKI中的水平变化 AKI是临床常见综合征，指肾功能在短期内下降，表现为血肌酐升高、尿量减少、水电解质紊乱等，常见于脓毒症、大手术、心源性休克、药物损伤等情况，在医院内尤其是ICU发生率逐渐升高，影响患者预后，部分可引起慢性肾脏损害，甚至导致死亡[13，14]。多种原因导致的AKI模型包括缺血再灌注(IR)损伤、脓毒症、输尿管梗阻、低血容量及肾毒性药物等均可检测到肾脏Klotho产生减少，提示Klotho的表达降低在肾前性、肾实质性及肾后性AKI中普遍存在。一项大鼠肾脏IR损伤模型试验检测了肾脏灌注不同时间点的Klotho水平，发现在肾脏灌注的第1天Klotho明显降低，在灌注的第3天和第4天肾脏Klotho的基因和蛋白表达水平恢复到基线水平。一项回顾性研究检测了21例AKI患者的肾脏Klotho表达，发现其水平显著下降,且与血肌酐基线水平和峰值均呈负相关[15]。叶酸诱导的肾毒性AKI小鼠模型中肾脏Klotho mRNA的表达降低维持到第7天尚未恢复，而此时血肌酐水平已经基本恢复到基线水平，表明Klotho转录表达水平的恢复比肾功能的恢复晚，但其是否能够预测AKI进展至慢性肾脏病尚不明确。除了肾脏中Klotho的表达降低，血浆和尿液中也有相似的变化，多项啮齿类动物试验检测到在缺血性AKI中，血浆和尿液可溶性Klotho在肾脏再灌注3 h开始下降，2 d后逐渐升高，7 d基本恢复到基线水平，这与肾脏中的表达改变基本一致。肾毒性药物导致的AKI中也观察到血浆Klotho水平的降低。肾移植患者中肾功能延迟恢复者的血浆Klotho水平较早期恢复者明显降低，这种差别在移植术后2年仍可检测到。

AKI中Klotho快速下降的机制尚不完全明确。IR损伤导致的AKI中肾脏Klotho蛋白水平的下降幅度明显大于mRNA的下降，表明除转录水平降低外尚存在其他的原因导致Klotho水平降低。氧化应激和炎症因子活化是AKI病理过程中的重要特点，二者均可在一定程度上抑制Klotho的产生[10]。

2.2 Klotho对AKI的诊断价值 AKI的早期诊断非常重要，目前较灵敏的指标包括尿液或(和)血浆中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)和尿肾脏损伤分子-1，这些标志物在AKI中均表现为水平升高，其中NGAL在再灌注后5 h即可检测到明显升高，大大缩短了AKI的诊断时限。血浆和肾脏中Klotho水平在小鼠肾脏再灌注后3 h明显下降，较NGAL的升高更加提前，表明其具有良好的早期诊断价值，与上述生物标记物联合检测能提高AKI诊断的灵敏性和特异性。研究发现AKI患者肾脏Klotho表达降低与肾损害严重程度相关，且能预测肾功能的短期恢复情况[15]。在AKI的鉴别诊断方面Klotho也有一定价值。有研究[16]比较了肾前性和肾实质性AKI的SD大鼠尿Klotho水平，发现肾前性AKI大鼠的尿Klotho水平较肾实质性AKI明显下降，而血、尿NGAL水平差异无统计学意义。Liu等[17]研究发现，心脏瓣膜置换术后AKI患者较未发生AKI患者的即时血液Klotho水平明显降低，而这种差别在术后24 h逐渐消失，表明血液Klotho水平可作为AKI超早期(1 d)的生物学标志物,而在术后较长时间(2～3 d)可检测血肌酐与Klotho比值提高AKI诊断的敏感性。目前Klotho作为AKI诊断的标志物仍有许多不足，如大部分为动物试验，以人类为对象的研究较少；尚没有理想的检测时机及正常范围等。

2.3 Klotho在AKI中的治疗作用 Klotho在AKI中表达降低，不仅是疾病的一种表现，也很可能参与了疾病的发生发展。多项动物试验表明，Klotho在AKI中起到保护作用。在缺血性肾损伤模型中，Klotho基因高表达的Tg-Kl小鼠较野生型小鼠肾损伤明显减轻，而低表达小鼠损伤更重，在缺血性肾损伤早期给予外源性重组Klotho同样能改善肾功能，降低NGAL水平。在大鼠的IR损伤模型中，应用腺病毒转导Klotho基因表达增加也能使血清肌酐显著降低，肾脏病理改变减轻及凋亡细胞减少。在抗肿瘤药顺铂诱导的肾实质性肾损伤模型中，Klotho基因缺陷的杂合子小鼠肾损伤较Klotho高表达的Tg-Kl小鼠明显加重，NGAL升高更显著，凋亡细胞更多，表明Klotho对缺血性及药物性AKI均有良好的肾保护作用。除预防性提高Klotho的水平可以显著减轻肾损伤外，在肾脏IR损伤30～60 min给予重组Klotho仍能有效地保护肾脏。但是Klotho的这种肾保护作用仍具有很强的时效性，在肾损伤前或肾损伤超早期给予效果最好，对于可以预知的AKI如心脏手术、冠脉造影、肾毒性药物的使用等情况可能会有较大的应用价值。

AKI不但能在短期内损伤肾功能，增加病死率，还可能引起慢性肾功能损害，导致肾纤维化。Klotho在改善AKI的早期预后、降低患病率和病死率的同时还对其晚期预后有明显的改善作用，在单侧输尿管梗阻诱导的肾损伤小鼠模型中，肾脏及血浆Klotho水平均明显降低的杂合子小鼠肾脏纤维化明显较野生型小鼠加重，表明Klotho能够抑制AKI后的肾脏纤维化，改善远期预后。Klotho保护急性肾脏损伤的机制可能与其抗氧化、抗凋亡、抗炎症[9]、抗衰老[7，8]和促进血管生成等作用有关。

综上所述，Klotho具有抗衰老、抗凋亡、抗氧化应激、保护血管等广泛生物学作用，与AKI关系密切，不但是其早期生物学标志物，且可能参与病理过程，并可作为治疗靶点发挥作用。

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