miR-21在脂多糖诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞炎症反应中的变化及其作用

王平军，曾其毅

(南方医科大学珠江医院，广州 510282)

脓毒症是感染导致的全身性炎症反应，可导致脓毒症急性肾损伤[1～3]。脓毒症急性肾损伤病情严重，病死率为40%～60%[4]。脂多糖(LPS)是革兰阴性菌细胞膜的组成成分，常作为外来毒素建立脓毒症急性肾损伤模型[5]。研究表明，细胞凋亡与炎症反应共同导致了脓毒症急性肾损伤[1,6,7]。miRNA是一种内源性非编码单链小分子RNA，通过降解mRNA或抑制mRNA翻译，在转录后水平负性调节基因表达[8～10]。miR-21是一种抗凋亡因子，其抗凋亡作用或参与脓毒症急性肾损伤[1～6]。但miR-21与LPS诱导的人肾皮质近曲小管上皮细胞炎症反应的关系鲜见报道。2017年3月～2018年2月，本研究观察了LPS诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞炎症反应后miR-21的表达变化，旨在探讨miR-21在脓毒症急性肾损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HK-2细胞，中国典型培养物保藏中心细胞库；PBS、MEM培养基、NEAA，广州一科生物科技有限公司；FBS、青-链霉素双抗、DMSO，美国Gibco公司；LPS，美国Sigma公司。TRIzol RNAiso,日本TaKaRa公司；mRNA及miRNA逆转录试剂盒，南京诺维赞生物科技有限公司；定量PCR试剂盒，北京百泰克生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒，江苏凯基生物技术股份有限公司；IL-6一抗，沈阳万类生物科技有限公司；GAPDH一抗，美国Bioworld公司；Lipofectamine3000美国Life Technologies公司；兔IgG二抗，南方医科大学南方医院。

1.2 细胞培养、分组及处理 将细胞接种于含10% FBS、1%青-链霉素双抗、1% NEAA的MEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。当细胞融合80%～90%时传代，传代次日更换新的培养基，之后每2～3天更换培养基1次。对照组和LPS组：对照组以等量PBS处理，LPS组以终浓度10 μg/mL LPS诱导4、8、12 h。转染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h组或NC mimics (50 nmol) 24 h组(即转染阴性对照物组)：转染miR-21 mimics或NC mimics的HK-2细胞，先采用基本培养基培养12 h，然后再用完全培养基培养12 h。转染miR-21 mimics (50 nmol)24 h+LPS处理组和转染阴性对照处理1组：转染miR-21 mimics或NC mimics (50 nmol) 24 h后再给予10 μg/mL LPS诱导8 h。转染miR-21 mimics(100 nmol)24 h +LPS处理组和转染阴性对照处理2组：转染miR-21 mimics或NC mimics 24 h后再给予10 μg/mL的LPS诱导12或24 h。

1.3 IL-6 mRNA及miR-21表达检测 采用RT-qPCR法。总RNA提取：TRIzol法提取总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格。逆转录及扩增引物：采用逆转录试剂盒和特异性miRNA茎环引物进行miR-21的逆转录，实时荧光定量PCR试剂盒进行实时荧光定量。逆转录反应条件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。将逆转录获得的cDNA加入40 μL DEPC水稀释5倍，- 20 ℃保存。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性15 s、60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s共40～50个循环。IL-6逆转录反应条件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。将逆转录获得的cDNA加入40 μL DEPC水稀释5倍，- 20 ℃保存。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性15 s、60 ℃退火 15 s、72 ℃延伸30 s共40～50个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。将对照细胞目的基因相对表达量设为1，计算其他各组目的基因相对表达量。

1.4 IL-6蛋白表达检测 采用Western blotting法。培养的细胞贴壁后，吸弃完全培养基，加入1 mL冷的PBS冲洗2次，每次振摇数次，尽量去除培养基；在每毫升预冷的Lysis Buffer中加入10 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL PMSF，混匀。每培养皿或6孔板所需的Lysis Buffer体积为50～100 μL，然后按样品个数计算所需的Lysis Buffer总体积，冰上保存待用。在每培养皿或6孔板加入等体积的Lysis Buffer，然后用刷子刮下培养皿或6孔板中的贴壁细胞，转移至1.5 mL EP管中。将所有样品置于4 ℃摇床平台，剧烈振荡30 s，冰上放置4 min，重复5次。4 ℃ 12 000 g离心5 min，上清即为提取的细胞总蛋白，- 80 ℃保存。采用Bradford法进行蛋白定量。将96孔板置于振荡器上震荡20 s，排除气泡，放置2 min，酶标仪于595 nm波长处检测各孔的吸光度值，以蛋白含量(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。蛋白样品1 μL+去离子水4 μL(即为5倍稀释)，加入考马斯亮蓝G250溶液195 μL，震荡混匀，放置2 min，酶标仪于595 nm波长处检测各孔的吸光度值，根据标准曲线得到相应的蛋白含量。蛋白变性及分装保存：5× SDS-PAGE蛋白上样缓冲液loading buffer 要先振荡离心，吸液时枪头垂直液面缓慢吸出，避免触及管壁。按每4 μL蛋白样品中加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，振荡混匀，管口覆盖封口膜，沸水加热5 min，使蛋白充分变性。蛋白条带获取：先配胶，然后电泳(上样量为60 μg)，再转膜(将蛋白转至PVDF 膜)，BSA封闭1.5 h，洗膜3次，一抗封闭过夜，次日洗膜3次后二抗避光封闭1 h，避光洗膜3次，最后用Odyssey双色红外荧光扫描成像系统获得图片。用Image J软件分析各蛋白电泳条带灰度值，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。将对照细胞目的蛋白相对表达量设为1，计算其他各组目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 LPS对HK-2细胞IL-6 mRNA及蛋白表达的影响 LPS组LPS诱导4、8、12 h IL-6 mRNA相对表达量分别为12.82±0.34、3.01±0.49、2.61±0.51，均较对照组明显升高(P均<0.05)。在4 h时IL-6升高达到峰值，随后迅速下降。LPS组LPS诱导4、8、12 h IL-6蛋白相对表达量分别为3.13±0.33、2.79±0.51、2.69±0.21，均较对照组明显升高(P均<0.05)。

2.2 LPS对HK-2细胞miR-21表达的影响 LPS组LPS诱导4、8、12 h miR-21相对表达量分别为0.71±0.07、0.73±0.03、0.68±0.08，均较对照组明显下降(P均<0.05)。

2.3 过表达miR-21对LPS诱导HK-2细胞IL-6 mRNA表达的影响 转染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h组miR-21相对表达量为17.07±1.40，较转染阴性对照物组表达明显升高(P<0.01)，说明转染成功。转染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h+LPS处理组IL-6 mRNA相对表达量为0.68±0.07，较转染阴性对照处理1组明显降低(P<0.05)。

2.4 过表达miR-21对LPS诱导HK-2细胞IL-6蛋白表达的影响 转染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS处理组LPS诱导12 h miR-21相对表达量为6.85±1.77，较转染阴性对照处理2组表达明显升高(P<0.05)，说明转染成功。转染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS处理组LPS诱导24 h IL-6蛋白相对表达量为0.52±0.15，较转染阴性对照处理2组表达明显降低(P<0.01)。

3 讨论

在HK-2细胞脓毒症急性肾损伤细胞模型中，以往文献一般以0、4、8、12 h作为时间点，以0、1、5、10 μg/mL作为LPS的诱导浓度，最后选用5 μg/mL LPS诱导8 h来建立模型[5,11]。本实验选择10 μg/mL作为LPS诱导浓度，诱导时间分别为0、4、8、12 h。本研究结果显示，在LPS诱导HK-2细胞4、8、12 h后，与对照组比较(等量PBS处理12 h)，IL-6 mRNA和蛋白相对表达量均明显升高，与以往文献[5]报道一致，表明本实验建立的脓毒症急性肾损伤细胞模型是成功的。越来越多研究表明，miRNA在脓毒症或脓毒症急性肾损伤中具有重要作用，如miR-21[1,3,6,10]、miR-375[2]、miR-210[12]、miR-107[13]、miR-23b[14]、miR-146a[15,16]、miR-132[17]。以往研究证实，脓毒症时miR-21表达上升[18]，急性肾损伤时miR-21表达亦上升[19]。然而，在脓毒症急性肾损伤时miR-21表达变化鲜见报道。本研究结果发现，miR-21在脓毒症急性肾损伤HK-2细胞中的表达明显下降，表明miR-21可能参与脓毒症急性肾损伤中的炎症反应过程。

miRNA几乎参与每个细胞过程，可调节人类大约1/3的基因[6]，是肿瘤与炎症反应中重要的调节者[2]。miR-21被发现在所有肿瘤中表达上升[20,21]，可作为肿瘤的生物学标志物[22～24]。另外一些研究则关注miR-21在肿瘤中的作用[25,26]。miR-21在许多疾病发生、发展过程中是一种强力的抗凋亡因子。在脓毒症急性肾损伤研究中，miR-21的抗凋亡作用亦参与其中[1,6]。有研究显示，miRNA与脓毒症的调节相关，具有抗炎或促炎作用。在脓毒症或其他炎症反应中，促炎的miRNA有miR-155[27,28]、miR-375[2]，抗炎的miRNA有miR-21[10,29～31]、miR-210[11]、miR-146a[15]。以往研究证实，miR-21与炎症反应有关[29,30,32]，但鲜有研究关注miR-21与脓毒症急性肾损伤的关系[10]。本研究结果发现，过表达miR-21能够降低LPS诱导的HK-2细胞IL-6 mRNA和蛋白表达。表明miR-21在脓毒症急性肾损伤中可能具有抗炎作用，与以往研究[10,29,30]基本一致。

总之，IL-6在LPS诱导的HK-2细胞中表达升高、miR-21表达降低。过表达miR-21能够降低LPS诱导的HK-2细胞IL-6 mRNA和蛋白表达，证实miR-21在脓毒症急性肾损伤中可能具有抗炎作用，有可能作为脓毒症急性肾损伤治疗的新靶点。