肝细胞癌中循环肿瘤细胞的检测技术及临床应用进展

彭邦剑，黄文斌，赵娟娟，潘明新

(南方医科大学珠江医院，广州 510280)

肝细胞癌(HCC)是临床最常见的恶性肿瘤之一，多数患者就诊时已处于中晚期，错过了根治性手术的最佳时机，即使可行手术治疗，术后也极易复发，预后较差。早发现、早诊断、早治疗可明显提高HCC患者的生存时间和生存质量。甲胎蛋白(AFP)作为HCC最经典的血清肿瘤标志物，已在临床上普遍使用，但其敏感性和特异性都不令人满意。因此，寻找敏感、特异的肿瘤标志物一直临床研究的热点。循环肿瘤细胞(CTCs)是存在于外周血循环中各类肿瘤细胞的统称，可自发或因诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落。大部分CTCs在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，只有极少数肿瘤细胞在循环系统中存活下来。由于其在人体外周血中含量极少，在大量的血细胞中富集并鉴定出这一类特殊细胞非常困难。目前主要通过物理特性或生物学特性等从外周血中富集CTCs，富集到的CTCs再经免疫荧光标记法、RNA原位杂交法、流式细胞术、细胞的核质比例法进一步排除非CTCs。现已证实，CTCs在肝癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤血行转移过程中发挥关键作用[1]。本文结合文献就HCC中CTCs的检测技术及其临床应用研究进展作一综述。

1 HCC外周血中CTCs检测技术

CTCs在肿瘤患者外周血中含量极少，即使在已知的转移性肿瘤患者外周血中也存在很少，故从大量血细胞中富集并鉴定出这一类特殊细胞非常困难。目前，临床上可用于富集CTCs的技术近百余种，其原理主要是基于CTCs的物理特性和生物学特性，但均无法避免血细胞污染。要进一步明确CTCs与肿瘤生物学的关系，避免其他细胞的影响，必须对富集的CTCs进行鉴定。目前常用的鉴定方法主要有基于免疫荧光标记法、RNA原位杂交法、流式细胞术、细胞的核质比例法等。

1.1 CTCs富集技术 基于CTCs物理特性的技术主要集中在尺寸大小、可塑性、密度梯度或介电性质等方面。由于CTCs密度比红细胞、中性粒细胞小，依据这一特性，通过密度梯度离心的方法分离外周血中不同的细胞组分，这是早期分离CTCs的方法，目前已很少单独使用该方法富集CTCs。商业化产品CanpatrolTM系统、ISET®系统和ScreenCell®系统等利用具有一定大小孔径的微孔滤膜富集CTCs，由于白细胞尺寸偏小且容易形变，能通过微孔被去除，而CTCs尺寸较大且细胞骨架较硬，不易形变，很难通过滤膜而被截留下来。Qi等[2]通过CanpatrolTM系统从112例HCC患者(包含早期HCC)外周血中富集CTCs，其中111例患者富集到CTCs。ApoStream®系统是利用电介质的差异来富集CTCs，其在血液中捕获肿瘤细胞的效率超过75%，其捕获的MDA-MB-231细胞的存活率高于97.1%，并且培养至第7天时细胞生长没有差异。由于根据物理特性筛选CTCs易混杂其他血细胞，并且可能会遗漏掉部分肿瘤细胞，目前采用物理特性的方法富集CTCs的研究越来越少。

在生物学特性中，大多数方法是基于免疫亲和性，如免疫磁珠富集法、流式细胞术分选等。免疫磁珠富集法是指依靠细胞表面标志物，将抗体包被在磁珠表面成为免疫磁珠，主要分为正向富集和负向富集。CellSearch®系统采用正向富集的策略，基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)阳性CTCs，将肿瘤细胞上皮标志物EpCAM抗体包被在磁珠表面，通过EpCAM抗体特异结合在CTCs表面，在外加磁场的作用下分选出CTCs。Sun等[3]采用CellSearch®系统对73例接受HCC手术患者进行CTCs分布模式研究，结果发现，在外周静脉血、外周动脉血、肝静脉、肝后下腔静脉和门静脉中富集到CTCs的患者比例分别为68.49%、45.21%、80.82%、39.72%和58.90%。负向富集是通过剔除血细胞的方法来分选CTCs。Guo等[4]采用负向富集的方法结合多标志物组合模型对60例HCC患者外周血进行观察，结果发现术后1个月患者外周血CTCs明显下降。表明CTCs模型在HCC诊断中具有较高的敏感性和特异性，可作为风险预测和治疗监测的实时参数。此外，随着流式细胞术分选技术的发展，其也逐渐被用于CTCs富集。有研究发现，流式细胞分选技术检测CTCs在体外是可行的，并与RT-PCR检测结果一致，但其在体内检测敏感性较差，与RT-PCR检测结果不一致，这使流式细胞术单独应用于CTCs富集受到了限制。但流式细胞术联合其他富集技术在CTCs提纯方面具有较好的效果，为进一步在形态学、细胞学、遗传学等方面分析CTCs提供了基础[5]。D′Avola等[6]描述了一种结合成像流式细胞仪和单细胞RNA测序(scRNA-seq)来识别患者CTCs的方法，其利用CD45阴性富集去除白细胞，然后使用IFC选择CTCs，最后进行scRNA-seq，该系统捕获效率高达65%，并且该系统获得的CTCs基因表达谱存在明显异质性，这或许可为个性化检测CTCs以及制定相关治疗方案提供新方法。但到目前为止，基于EpCAM的CellSearch®系统仍然是惟一一个获得FDA(2004年获批)和CFDA(2012年获批)批准,用于恶性肿瘤检测CTCs的商业化产品。

微流控芯片技术富集CTCs需要极少的血液数量，无论是基于物理特性还是生物学特性，均具有较高的敏感性，近年来受到越来越多关注。当外周血细胞流过微流控芯片时，目标抗体阳性的CTCs将会停留下来。有研究将配体-受体结合测定应用于微流体装置中的CTCs芯片，其在人造CTCs血液样品中的捕获率超过85%，在36例HCC患者中检测到的CTCs为(14±10)个/2 mL[7]。Qin等[8]开发了一种新型简单的楔形微流体装置，用于高效分离癌症患者血液样本中的CTCs，该方法对HepG2、SKBR3、A549、BGC823四种肝癌细胞表现出优异的分离性能(超过85%的捕获效率)；在临床试验中，该平台鉴定的HCC患者外周血CTCs阳性率为83.3%。类似地，HB Chip、GEM Chip和GO Chip通过设计微管道的结构，并在管道上包被EpCAM抗体，当外周血流经包被有EpCAM抗体的管道时，CTCs被捕获并固定在芯片表面上。目前，采用多种抗体组合模型的微流控芯片技术用于富集HCC患者外周血CTCs已经成熟，这种方法有能力去捕获那些EpCAM低表达或者不表达的CTCs，但这种方法必须找到合适的标志物区别于非CTCs，才能被临床应用。此外，Kalinich等[9]介绍了一种高通量微流体的CTC-iChip，它能有效地从血液标本中消耗造血细胞，并为CTCs提供保存完好的RNA，可为后续下游形态学、免疫细胞学和遗传学等研究提供完整的细胞结构。

CTCs富集技术多种多样，无论是基于物理特性还是生物学特性，都不能很好地解释遗漏CTCs或者白细胞污染的问题，多重富集技术的组合模型可能是未来的一条出路，但要如何将这些技术规范化、正规化是一个难点，相信不久的将来会有更多新的CTCs富集方法或者组合模型出现，为后续的CTCs与HCC转移复发等机制的研究开辟新的道路。

1.2 鉴定技术 免疫荧光标记是最常用的一种CTCs鉴定技术，该技术主要基于细胞抗原-抗体反应来将CTCs区别于其他细胞，故合适的荧光抗体或荧光抗体组合是关键。CellSearch®系统是使用该方法对CTCs进行鉴定，在这个平台上，通过使用一种核内染色剂(DAPI)来进行免疫组化染色，其中的荧光抗体可特异性反向结合CD45，也可与CK8、CK18、CK19(细胞质上皮标志物)结合。但有研究发现，CTCs在脱离肿瘤组织进入血液进行远处转移的过程中，会发生上皮-间质转化(EMT)。与其他上皮性肿瘤不同，大部分HCC细胞并不表达EpCAM，这在一定程度上限制了基于EpCAM技术在临床上的应用。Liu等[10]使用一种基于磁珠负性富集的方法去除CD45+白细胞，并改进了识别CTCs的标志物，该团队应用三种组合抗体——CD45-、去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)来标记HCC外周血CTCs，最后采用三重免疫荧光染色处理的方法，将目标细胞分选出来，结果在91%(29/32)的HCC患者中检测到了ASGPR和(或)CPS1+CTCs，而在其他肿瘤患者中未检测到，抗ASGPR和CPS1单克隆抗体的混合物比单独任一抗体鉴定HCC细胞的敏感性和特异性明显增加。此外，包括DAPI+、CD45-、ASGPR+、HspPar1+、DAPI+、CD45-、CK+、pERK/Akt+等在内的标志物抗体组合也被用于CTCs的鉴定技术。

通过多重探针标记的RNA原位杂交法实现CTCs鉴定和分型也是常见的鉴定方法之一。Canpatrol系统[11]即是应用这一原理，该系统针对EMT途径，同时对上皮标志物(如EpCAM、CK8、CK18、CK19)和间质标志物(如Twist、Vimentin)进行检测。有研究表明，在HCC患者外周血中，间质型CTCs更多见于出现转移患者的外周血样本中，并且存在的数量越多，提示患者预后越差[12]。Qi等[2]应用该系统发现，112例HCC患者(包含早期HCC)中有111例(90.18%)CTCs阳性；另外，在12例乙型肝炎病毒感染患者中，有2例患者亦检测到CTCs，这2例患者在5个月内均检测到微小HCC。除了商业化产品Canpatrol系统外，Guo等[4]对HCC外周血首先采用CD45负性富集，然后利用qRT-PCR的方法对多标记物表征(EpCAM、CD133、CD90和CK19)的CTCs进行鉴定，结果发现该鉴定技术在HCC的诊断中具有高度敏感性和特异性，可作为风险预测和治疗监测的实时参数。

免疫荧光标记法和RNA原位杂交法是目前常用的两种CTCs鉴定技术，但是这两种技术都高度依赖相应的标志物，表征CTCs标志物不同将直接导致CTCs鉴定的敏感性和特异性不同。此外，基于流式细胞术、细胞的核质比例法等也有文献报道。Ogle等[13]首先采用负向富集的方法剔除血细胞，剩下的细胞悬液采用流式细胞成像术检测细胞角蛋白、EpCAM、AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和DNA-PK，然后分析大小、形态和DNA含量，依此来鉴定HCC外周血CTCs，结果发现，在65.2%的HCC患者血液样本中检测到1～1 642个CTCs。Guo等[14]发现了一种新的策略来检测HCC外周血CTCs，同样利用流式细胞仪分选，该系统基于HCC患者外周血细胞的核质比例联合生物标志物EpCAM和CD45分选CTCs，而不是传统的单一标志物或者多标志物联合检测，结果发现这个新的CTCs鉴定方法更敏感和更可靠。

CTCs能否预测临床结局并进一步评估抗肿瘤药物的治疗效果，最终还要依赖CTCs鉴定技术是否准确可靠。但至今关于HCC的CTCs检测仍然没有统一标准，其检测结果的准确性和可靠性是CTCs在临床应用中面临的最大挑战，不断提高CTCs检测技术并使之规范化成为了今后研究CTCs的重点。

2 HCC外周血CTCs检测的临床应用

目前多种多样的富集方法和多分子靶标联合应用已经使得肝癌CTCs的富集与鉴定技术获得了较好的敏感性和特异性，在临床分期、预后评价和疗效评估等方面已经逐步开展相应的研究并取得了一定成果。

2.1 临床分期 研究表明，外周血CTCs阳性率及肿瘤分期(BCLC分期、TNM分期)呈正相关关系，有肉眼血管侵犯及肝外转移患者体内CTCs阳性率更高。Schulze等[15]应用CellSearch®系统检测HCC外周血发现，CTCs计数与患者总生存率、BCLC分期、微血管侵犯、AFP等密切相关，这与Sun等[1]报道基本一致。CTCs分为上皮型、混合型、间质型三种，不同表型的CTCs能从不同方面反映HCC患者临床特征，可作为评估HCC患者病情的辅助指标。应用CellSearch®系统检测HCC外周血CTCs时还发现，在很多TNM分期提示为早期HCC患者外周血中也能检测到CTCs[8]，这从侧面反映HCC早期即有可能发展为全身性疾病，仅仅依靠现有的临床分期不能真实反映HCC的生物学特点。因此，倘若能够将CTCs应用于常规检查，如同乳腺癌一样纳入NCCN指南将会有利于HCCs患者的早期诊断，并能监测患者预后，进而延长患者的生存期。

2.2 预后判断 Sun等[1]首次描述了在HCC患者中使用CellSearch®系统检测EpCAM阳性CTCs，认为术前CTCs计数≥2是HCC患者术后复发的预测因子。有文献报道，CTCs计数与HCC患者不良临床病理特征相关，并且可能预示患者预后不良，Sun等[16]的荟萃分析也证实了这一结论。Wang等[12]采集了62例行根治性切除术后HCC患者外周血5 mL，采用CanPatrol系统进行分析，发现切除术后总CTCs、混合型CTCs和间质型CTCs复发率明显增高，而上皮型CTCs复发率没有差别。Ou等[17]应用CanPatrol系统在根治性手术前从165例HCC患者获得外周血样品检测CTCs，结果表明间质型CTCs的存在提示最短的无复发生存率，其次是混合型CTCs，然后是上皮型CTCs，这与Wang等[18]报道基本一致。

2.3 疗效评估 CTCs的检测在评价分期及预后方面已有大量文献报道，然而在监测疗效方面相对较少。Shen等[19]评估了EpCAM阳性CTCs计数在预测不能切除的HCC患者经导管动脉化疗栓塞后死亡风险，将89例患者分为3组，即低度组(CTCs计数为0～1)、中度组(CTCs计数为2～5)和高度组(CTCs计数≥6)，结果发现高、中度组死亡风险分别为低度组的2.819(95%CI：1.218～6.526)、1.301倍(95%CI：0.630～2.685)。Guo等[4]对多标记物表征的肝细胞特征CTCs进行大样本研究，结果证实其在HCC中具有高度敏感性和特异性，可作为风险预测和治疗监测的实时参数，肿瘤切除后CTCs负荷持续高值患者具有明显复发倾向，可早期制定有效的抗肿瘤策略。此外，包括pERK和pAkt，EMT标志物(Twist和波形蛋白)，MAGE-3和生存素，CK、EpCAM和Glypican-3，膜联蛋白V、EpCAM、ASGPR1和TAMPs等多标记组合的CTCs检测也可用于评估转移、预后以及监测药物治疗效果。

综上所述，CTCs分析可能为临床医生和研究人员提供个性化策略，因为CTCs是敏感的生物标志物，有望在早期诊断、预后评价、实时监测和药物耐药等方面发挥重要作用，以促进精准医学的实施。因此，进一步筛选高存活力、高转移性的肝癌CTCs子集，是深入研究HCC靶向转移机制的关键一步。然而，在临床上应用CTCs分析前，必须建立一种能够捕获全部CTCs高敏感性和特异性的方法。目前，大多数研究是单中心病例对照研究，样本量有限，今后需要进行足够样本量和长期随访的多中心前瞻性研究，以评估CTCs检测和鉴定方法，以便CTCs更好地用于HCC临床分期、预后评价和疗效评估等。