足细胞自噬在肾小球疾病中的研究进展

凌春燕 综述，王 琳 审校

(上海中医药大学附属龙华医院肾病科 200032)

自噬是真核细胞内溶酶体依赖性蛋白降解的过程，自噬在饥饿、缺氧、缺血/再灌注、感染等条件下可以被激活，以维持细胞内环境稳定，调节能量代谢。足细胞是肾小球滤过屏障的主要成分，其结构和功能的完整性决定着肾小球滤过功能的完整性。因足细胞是高度分化的终末期细胞，当其丢失超过40%时，球囊粘连明显增加，导致肾小球硬化增加，产生持续大量蛋白尿，乃至肾功能异常[1]。各种病理改变导致足细胞受损会使其从肾小球基底膜(GBM)脱落，造成滤过屏障完整性受损，最终导致蛋白尿产生。本文就足细胞在生理和病理情况下，自噬对其的作用及在肾脏疾病中发挥何种效应进行综述。

1 细胞自噬(autophagy)

细胞自噬依据其分子机制、溶酶体摄入底物的方式等不同分为巨自噬、小自噬和分子伴侣介导自噬，目前通常说的“自噬”是指巨自噬，细胞自噬主要分为以下步骤：细胞接受自噬诱导信号，在细胞质某处形成吞噬泡(phagophores)；吞噬泡不断延伸，将细胞质中的任何成分包括细胞器全部纳入，形成密封的、球形自噬体(autophagosome)；自噬体形成后与溶酶体融合形成自体溶酶体(autolysosome)；自噬体的内膜被降解，二者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”被降解，产生氨基酸、脂肪酸等被输送到细胞质中，供细胞重新利用[2]。

2 自噬相关信号通路

2.1哺乳动物雷帕霉素蛋白靶蛋白(mTOR)相关信号通路 mTOR是细胞生长调节的关键，mTOR激活抑制细胞自噬的发生。细胞中缺乏营养物质(如生长因子或氨基酸等)时，可通过抑制mTOR的表达，其后不仅可以激活Ⅲ类磷脂酰肌醇3-激酶(Class Ⅲ PI3K)和UNC-51样激酶1(ULK1)，还可以抑制核糖体蛋白亚基6激酶(S6K1)活性，激活细胞自噬[3]。mTORC1(与自噬相关)活性受到细胞对氨基酸摄入水平的影响，受尿苷三磷酸酶(GTPases)和有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)3介导[4]。细胞在缺乏能量时ATP/AMP比值降低，细胞会启动依赖AMP活化蛋白激酶(AMPK)的自噬过程来获得能量[5]。

2.2PI3K/蛋白质激酶B(AKT)信号通路 PI3K是真核生物体内重要的信号分子。20世纪80年代，发现Ⅲ型PI3K分子抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)能抑制自噬[6]。AKT是PI3K/AKT信号通路的核心。正常生理条件下，络氨酸激酶受体被细胞外及细胞内因子活化，进而激活PI3K，活化的PI3K将底物磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)转化为磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)，使PIP3与磷酸肌醇依赖的激酶-1(PDK-1)协同完全激活AKT，继而信号传至mTOR，活化后的mTOR激活下游相关因子，抑制细胞自噬[7]。

2.3活性氧(ROS)信号通路 研究发现ROS参与细胞自噬的发生[8]。神经生长因子(NGF)缺陷时，大量ROS在线粒体蓄积，引起线粒体膜脂质过氧化，导致线粒体功能异常，进而激活自噬。ROS还可上调Atg4产生Atg8-磷脂酰胺(PE)复合体，促进复合体在细胞内累积，最终促进细胞自噬[5]。

2.4c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路 JNK是一种p54微管相关蛋白激酶，主要通过以下机制调节自噬：(1)通过磷酸化Bcl-2/Bcl-XL解离Beclin-1-Bcl-2/Bcl-XL复合体释放Beclin-1；(2)通过介导Bcl-2的磷酸化阻碍Bcl-2/Bcl-XL与Beclin-1形成复合体[9]。

3 足细胞自噬及其在慢性肾脏病中的作用

有研究发现肾脏中的足细胞内自噬水平比其他细胞高，足细胞依赖自噬反应维持自身内环境的稳定[10]。有基础研究检测到正常足细胞内存在自噬泡，氯喹通过时间依赖方式增加自噬标志蛋白——微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ型的表达，说明足细胞自噬的高活性；该研究通过内毒素(LPS)诱导足细胞损伤，降低足细胞podocin、LC3Ⅱ和Beclin-1表达，使自噬体数量减少；而雷帕霉素(RAPA)可逆转LC3Ⅱ和podocin低表达，3-MA可加重LPS的损伤作用[11]。HARTLEBEN等[12]通过观察特异性敲除足细胞内ATG5基因的小鼠，发现小鼠足细胞丧失自噬能力后增加了其患肾病的风险，表明细胞自噬不仅能在正常情况下维持足细胞的自稳状态，而且也是应激条件下足细胞内自我保护的有效机制。

3.1糖尿病肾病(DN)中足细胞自噬情况 DN小鼠肾小球中发现足细胞和自噬体数量明显减少、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显下降，腹腔注射RAPA后，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，自噬功能恢复，蛋白尿减少[13]。高糖诱导足细胞损伤，在高糖作用72 h时足细胞损伤加重，细胞活性受抑制，自噬功能受抑制。p62/SQSM1基因敲除后，能明显改善足细胞受损情况，缓解胰岛素抵抗，说明足细胞自噬功能受抑制可能参与了DN的发病机制[14]。AUDZEYENKA等[15]研究发现，高糖诱导足细胞自噬水平下调，可能与其对胰岛素敏感性降低有关。DN患者常存在脂质代谢紊乱，棕榈酸(PA)能明显增加足细胞中ROS产生，降低足细胞线粒体膜电位，增加足细胞凋亡，氯喹干预加重足细胞的凋亡，RAPA能有效抑制棕榈酸诱导的ROS增多及细胞凋亡[16]。HUANG等[17]用高糖诱导人足细胞损伤，发现中药三七提取物——三七皂苷R1能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路恢复足细胞自噬功能，从而减少足细胞凋亡。上述研究表明，DN中存在足细胞自噬低表达情况，但具体分子机制尚不明确，可能与PI3K/AKT/mTOR信号通路有关[18]，也可能与肾脏衰老、氧化应激和内质网应激(ERS)及胰岛素抵抗有关[14-15,19]，改善足细胞自噬功能可能是延缓DN进展新的治疗靶点。

3.2IgA肾病(IgAN)中足细胞自噬情况 有研究发现，IgAN患者肾组织中足细胞自噬体的数量明显减少[20]，该研究纳入了35例病理确诊为IgAN的患者，病理分期都在LeeⅡ级以上，透过光镜和透射电镜观察足细胞结构和自噬体的变化。结果发现，与对照组相比，IgAN患者的足细胞自噬体明显减少，且随病理分期级别的增加，其自噬体的数量呈现上升趋势，LeeⅣ级的患者肾组织中足细胞自噬体明显较LeeⅡ级患者增多。LIANG等[21]进一步从IgAN患者和健康者血清中分离出IgA1用来体外培养小鼠系膜细胞48 h，制备IgA1-系膜细胞上清液，用该上清液培养小鼠足细胞(MPC5)。结果发现用IgAN患者IgA1-系膜细胞上清液培养的足细胞，其表达LC3 Ⅱ和CD63较健康者降低，p62蛋白累积，电子显微镜显示其比健康者IgA1-系膜细胞上清液干预的足细胞自噬体明显减少，凋亡蛋白caspase-3表达增加，足细胞凋亡增加。运用RAPA与IgA1-系膜细胞上清液共培养足细胞，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加30%，p62蛋白积累下降近50%，每个足细胞自噬体数量增加到单纯用IgA1-细胞细胞上清液干预的近7倍，凋亡率也从19.88%下降到16.78%，caspase-3蛋白表达降低。RAPA作为mTOR信号通路的抑制剂，自噬通路的激活剂，能通过上调足细胞自噬功能起到保护IgAN患者足细胞的作用，为IgAN的治疗提供了新靶点。

3.3膜性肾病(MN)中足细胞自噬情况 足细胞自噬功能异常同样参与了MN的发病机制。LIANG等[22]通过35例IgAN和26例特发性MN(IMN)患者足细胞自噬体的电镜检测，发现肾病患者足细胞自噬体数量都明显少于健康对照组(0～5个自噬体/足细胞)，两种肾病类型之间自噬体数量无差异。根据患者肾小球滤过率(eGFR)情况，分为eGFR≥60 mL/min和eGFR<60 mL/min两组，eGFR低的自噬体数比eGFR高的多。JIN等[23]研究纳入15例健康者、41例MN患者包括26例IMN(Ⅰ期14例、Ⅱ期12例)和15例继发性膜性肾病(SMN)，结果提示MN发病机制中可能存在足细胞自噬体减少的情况，这一现象随着病理分期从Ⅰ期到Ⅱ期呈现加重趋势。吕倩影等[24]通过亚溶破C5b-9诱导足细胞损伤，结果表明抑制自噬可以明显加重C5b-9诱导的足细胞形态异常，包括nephrin表达的进一步减少和分布异常，并且增加足细胞的凋亡。

早期动物实验发现，IMN经典被动Heyamnn肾炎大鼠发病机制中同时存在ERS激活和足细胞自噬功能活化现象，造模第14、21天，免疫组织化学结果显示与对照组相比，LC3沿着肾小球毛细血管袢高表达，并随着时间的增加，其表达逐渐增多[25]。非折叠蛋白反应诱导剂(UPR)——衣霉素2.5 ng/mL干预MPC5 10 h，诱导ERS活化，自噬增强，细胞骨架围微管蛋白Tubulin表达降低、排列紊乱。加用PI3K阻断剂与衣霉素共同干预足细胞后，与衣霉素组相比，LC3 Ⅱ表达明显降低，Tubulin蛋白表达上升。说明在体内外实验中均存在ERS激活，造成足细胞损伤(未凋亡)，自噬功能可改善ERS造成的足细胞损伤。体内外研究发现，与在人类肾组织中的表现并不完全相同，可能是因为动物并不能完全替代人类IMN的发病机制，但足细胞自噬功能的调节确实能起保护足细胞的作用，具体表现可能是早期的自噬激活，进行细胞自身的修复，晚期随着疾病的进展，各种病理表现的加重，足细胞自噬功能受到抑制，自我修复自救能力降低，造成足细胞损伤的不可挽救，病情持续快速进展，跟临床表现的肾病终末期进展加快相吻合。

3.4狼疮性肾炎(LN)中足细胞自噬情况 在LN患者中，足细胞自噬功能异常存在于LN发病机制中。JIN等[23]纳入了60例LN患者，病理分级从Ⅱ～Ⅴ型，LN患者足细胞自噬体数量明显少于对照组，根据病理分级的加重，自噬体数量呈增多趋势，但各型间差异无统计学意义(P>0.05)，同时研究还观察到Ⅴ型LN患者(15例)足细胞内自噬体数量少于IMN组(26例)。SMN常继发于LN，属于自身免疫系统疾病，免疫功能的紊乱可能参与足细胞自噬体的形成，在IMN及LN发病机制中的致病作用可得到侧面体现。

3.5抗肾小球基底膜性肾炎(anti-GBM) anti-GBM系循环中抗基底膜抗体介导的自身免疫性疾病，单有肾脏损伤时称为anti-GBM。钙依赖性磷脂酶A2γ(iPLA2γ)属于磷脂酶A2受体家族，对补体介导的肾小球上皮细胞损伤时起保护作用。iPLA2γ基因敲除的小鼠并无蛋白尿的产生，但会导致线粒体结构异常，增加衰老足细胞的自体吞噬能力；有研究发现，iPLA2γ基因敲除幼鼠诱导anti-GBM后，与野生型相比，产生了明显的蛋白尿、足细胞足突融合和足细胞脱落。从两组小鼠中分离足细胞进行免疫印迹分析，iPLA2γ基因敲除小鼠足细胞骨架蛋白synaptopodin、Nephrin和podocalyxin表达均降低，足细胞骨架遭到破坏，足突间距拉大，LC3Ⅱ/Ⅰ比值明显增加，同时AMPK磷酸化水平明显较野生型增多[26]。iPLA2γ基因在正常足细胞及肾小球肾炎中起保护作用，其作用机制可能是通过调节自噬通路实现。

4 展 望

细胞自噬是一个相对复杂的过程，其在生理和病理上具有重要作用，以往的研究证实众多介质和信号通路参与其中，包括Beclin-1和2、ClassⅢ、PI3K/AKT、mTOR、AMPK、JNK、ROS等。目前的研究表明足细胞可以通过细胞自噬功能清除细胞内的损伤和衰老的细胞器，维持内环境的稳定，防止自身的损伤引起肾脏疾病。这些相关研究主要观察了足细胞自噬情况变化，了解其自噬能力丢失带来的影响，虽然证明了细胞自噬与足细胞损伤的相关性，但并不能阐明之间的确切因果关系。细胞自噬参与足细胞损伤导致的肾病蛋白尿和肾小球硬化中的具体作用机制，仍有待进一步深入研究。