血管过氧化物酶1在Ang-Ⅱ诱导血管平滑肌细胞表型转化中的作用及机制

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(1.南华大学附属第一医院心血管内科，湖南 衡阳 421001；2.中南大学湘雅医院心血管内科)

血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型转化即由收缩型向合成型转化在动脉粥样硬化、肺动脉高压、支架内再狭窄等血管增生性疾病中起重要作用[1-3]，但调节VSMCs表型转化的具体机制仍不明确。研究表明氧化应激参与VSMCs表型转化[4]，而VSMCs内的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)主要来源于还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶。血管过氧化物酶1(Vascular Peroxidase 1，VPO1)是一种新型的过氧化物酶，能催化NADPH氧化酶(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox)来源的过氧化氢(H2O2)产生氧化能力更强的次氯酸(Hypochlorous Acid，HOCl)加剧氧化应激[5]。血管紧张素Ⅱ(Ang-Ⅱ)通过上调Nox来源的ROS水平调节VSMCs的增殖和迁移[6]，也有研究表明VPO1在Ang-Ⅱ诱导VSMCs增殖中起重要作用[7]。因此推测，Ang-Ⅱ上调VSMCs内VPO1的表达，并通过加剧氧化应激调节VSMCs表型转化。

1 材料与方法

1.1材料DMEM培养基购自美国Corning公司，胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶购自美国Gibco公司，兔VPO1抗体、兔α-SMA抗体、兔SM22α抗体、兔KLF4抗体、兔OPN抗体、兔GAPDH一抗、3-氯酪氨酸抗体均购自美国Abcam公司，BCA蛋白定量试剂盒、H2O2检测试剂盒、western blot 一抗稀释液均购自江苏碧云天生物有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，VPO1siRNA、NC-siRNA购自中国广州锐博生物公司，逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas公司，PCR引物购自中国上海程生物公司，Real-PCR试剂盒日本Takara公司。

1.2原代大鼠主动脉平滑肌细胞提取、培养选体重约为100～120 g雄性SD大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后置于75%乙醇溶液中浸泡3 min后处死。剪开胸腔，分离并剪开主动脉，剔除内皮细胞和血管外膜，将动脉中膜剪成约2 mm×2 mm大小的组织块均匀平铺于细胞培养瓶底壁，加入含20%胎牛血清、双抗(100 U/L青霉素+100 mg/L链霉素)、4.5 g/L葡萄糖的DMEM培养基，放置于37 ℃、5%CO2培养箱中，待细胞铺满瓶底面积约80%～90%后用清除组织块，予以0.25%胰蛋白酶消化传代。3～8代细胞用于细胞实验。

1.3免疫荧光鉴定血管平滑肌细胞将细胞培养于放有无菌盖玻片的6孔培养板内，待细胞密度生长约为60%，PBS润洗3次，每次10 min，4% 多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗3次后以0.1% Triton-X 100 室温处理20 min，5%BSA室温封闭30 min，加平滑肌肌动蛋白(smooth muscle α-actin，α-SMA)一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜后PBS 漂洗3次，每次10 min，加荧光二抗 (1∶1 000)，避光孵育60 min，PBS漂洗后滴加DAPI(1∶10 000)5 min，PBS漂洗晾干后以10%甘油封片，避光保存，荧光显微镜下观察。

1.4 VPO1siRNA(si-VPO1)细胞转染接种约1×106个细胞至6孔板内，待每孔细胞密度生长约为30%～50%时，采用转染浓度为50 nmol/L siRNA严格按照试剂盒操作步骤进行转染，24 h后用real-time PCR和western blot检测转染效率。VPO1siRNA干扰序列为：5′-GUGGACUUGAAUGGAACAATT-3，由广州锐博生物公司合成，阴性对照siRNA(si-NC) 由该公司提供。

1.5 wstern blot蛋白检测提取细胞总蛋白，严格按照BCA蛋白定量试剂盒说明书测定蛋白浓度，取50 μg样本蛋白在10%SDS-PAGE的分离胶上进行蛋白电泳后转膜。将PVDF膜置于5%脱脂牛奶中室温下摇床上缓慢摇动封闭1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，加入相应浓度的一抗孵育，4 ℃过夜后复温1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，室温孵育二抗1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。用凝胶图像处理系统(Bio-Rad)进行半定量分析。

1.6 Real-Time PCR mRNA检测使用Trizol(Invitrogen，USA)从培养的细胞中提取总RNA，并按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit(TakaRa，Japan)试剂盒说明书逆转录成cDNA后，ABI 7500实时PCR系统(Foster City，USA)进行扩增。以GAPDH为内参对照，用ΔΔCt方法进行定量。引物序列如表1。

表1 引物序列

1.7 H2O2的检测收集细胞到离心管，加入适量的H2O2裂解液充分匀浆裂解细胞，4 ℃、12 000 rpm离心5 min，取上清做后续测定。H2O2检测试剂冰上溶解，标准溶液分别稀释成1、2、5、10、20、50 μmol/L，用96孔板检测，每孔加入50 μL标准品或者样品后，每孔再加入100 μL H2O2检测试剂，轻轻震荡混匀，室温静置30 min，立即测定A560的吸光值。

1.8 HOCl的检测因HOCl是一种氧化能力强且很不稳定的氧化剂，能与蛋白质酪氨酸残基发生氧化反应，生成稳定3-氯酪氨酸，因此通过western blot 检测3-氯酪氨酸表达情况可间接反应细胞内HOCl的生成[7]。

1.9统计方法所有数据均以均数±标准差表示，用SPSS 19.0软件进行分析。两组间比较检验正态性和方差齐性后采用t检验，多组间比较采用ANOVA分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1原代VSMCs的鉴定α-SMA是VSMCs的特征性抗原之一，采用免疫荧光检测α-SMA鉴定VSMCs，结果显示提取的原代细胞中95%以上α-SMA免疫荧光染色呈阳性。见图1。

图1 免疫荧光鉴定VSMCs

2.2 Ang-Ⅱ对VSMCs内VPO1蛋白及mRNA表达的影响以不同浓度的Ang-Ⅱ(0 nmol/L、10 nmol /L、100 nmol/L、1 μmol/L)孵育VSMCs 24 h发现VSMCs内VPO1蛋白及mRNA的表达均呈浓度依赖性的升高。以终浓度为100 nmol/L的Ang-Ⅱ孵育VSMCs 0、12、24、48 h发现VSMCs内VPO1蛋白及mRNA均呈时间依赖性的升高。见图2。

图2 Ang-Ⅱ对VSMCs内VPO1蛋白及mRNA表达的影响(n=4)A：western blot 检测VPO1蛋白表达的量效关系；B：RT-PCR检测VPO1mRNA表达的量效关系；C：western blot 检测VPO1蛋白表达的时效关系；D：RT-PCR检测VPO1mRNA表达的时效关系. 与Ang-Ⅱ0 nmol/L 0或0 h组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.3 Ang-Ⅱ对VSMCs相关标记蛋白和KLF4蛋白表达的影响α-SMA、平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)是VSMCs收缩型标记蛋白，骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是VSMCs合成型的标记蛋白，Krüppel样因子4(KLF4)是调节VSMCs表型转化的关键转录因子，观察SM22α、α-SMA、OPN和KLF4蛋白的表达变化可评估VSMCs的表型转化。与对照组相比，以浓度为100 nmol/L Ang-Ⅱ孵育VSMCs 24 h后SM22α、α-SMA蛋白表达明显下降，而OPN、KLF4蛋白表达明显升高。见图3。

图3 Ang-Ⅱ对VSMCs相关标记蛋白和KLF4蛋白表达的影响(n=4)A：western blot 检测SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的表达； B：SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的相对表达. 与Control比较，**P<0.01

2.4 VPO1基因沉默的鉴定与空白转染组相比，转染si-VPO1组的VSMCs内VPO1 mRNA及蛋白表达明显下降。见图4。

图4 VPO1基因沉默的鉴定(n=4)A：Real-time PCR检测VSMCs转染VPO1 siRNA后VPO1 mRNA的表达；B：Western Blot 检测VSMCs转染VPO1 siRNA后蛋白的表达. 与对照组相比，**P<0.01

2.5 VPO1基因沉默对Ang-Ⅱ培养VSMCs相关标记蛋白及KLF4蛋白表达的影响分别予以阴性对照siRNA (negative control siRNA) 或VPO1si RNA转染VSMCs 24 h，然后予以终浓度为100 nmol/L Ang-Ⅱ或不含Ang-Ⅱ的培养液VSMCs 24 h。结果显示：与si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-NC组VSMCs内SM22α、α-SMA 蛋白减少，见图5。而OPN、KLF4蛋白表达增加；与Ang-Ⅱ+ si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO1组VSMCs内SM22α、α-SMA 蛋白表达增加，而OPN、KLF4蛋白表达减少。见图5。

图5 VPO1基因沉默对Ang-Ⅱ培养VSMCs相关标记蛋白及KLF4蛋白表达的影响(n=4)A：Western blot检测α-SMA 、SM22α、OPN、KLF4蛋白表达；B：SM22α、α-SMA 、OPN、KFL4蛋白的相对表达.与NC-si RNA(-)组比较，**P<0.01；与NC-si(+)组比较，#P<0.05

2.6 VPO1基因沉默对Ang-Ⅱ培养VSMCs生成H2O2、HOCl的影响与si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-NC组上清液中H2O2的生成增加；与Ang-Ⅱ+si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO组上清液中H2O2的生成减少，但无统计学意义(P>0.05)。与si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-NC组3-氯络氨酸蛋白表达增加；与Ang-Ⅱ+si-NC组相比，Ang-Ⅱ+ si-VPO组3-氯络氨酸蛋白表达减少。见图6。

2.7 HOCl对VSMCs相关标记蛋白及KLF4蛋白表达的影响鉴于VPO1通过催化H2O2生成HOCl起作用，予以终浓度100 μmol/L HOCl培养VSMCs，结果发现：与对照组相比，HOCl组SM22α、α-SMA 蛋白表达减少，而OPN、KLF4蛋白表达增加。见图7。

图6 VPO1基因沉默对Ang-Ⅱ培养VSMCs 生成H2O2、HOCl的影响(n=4)A：可见光光度法检测H2O2浓度；B：western blot检测3-氯络氨酸的表达间接反应细胞内HOCl的生成. 与NC-si RNA(-)组相比，**P<0.01

图7 HOCl对VSMCs相关标记蛋白及KLF4蛋白的影响(n=4)A：western blot 检测SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的表达；B：SM22α、α-SMA、OPN、KLF4蛋白的相对表达. 与Control比较，**P<0.05

3 讨 论

VSMCs表型转化是其增殖、迁移及合成细胞外基质的前提，在动脉粥样硬化等血管增生性疾病中起重要作用[1]。最近研究发现VSMCs在人类新生内膜中大量聚集，被Allahverdian S 等[9]认为动脉粥样硬化是主要来源于VSMCs而非巨噬细胞参与的疾病。新近发表于Nature medicine研究发现在小鼠的动脉粥样硬化模型斑块内约80%的VSMCs收缩型标记蛋白α-SMA表达阴性，进一步证实VSMCs表型转化在动脉粥样硬化中作用[10]。肾素-血管紧张素系统(rennin-angiotensin system，RAS)在心血管疾病的病理生理过程中发挥重要作用，本课题予以Ang-Ⅱ培养VSMCs，结果发现Ang-Ⅱ下调VSMCs收缩型标志蛋白SM22α、α-SMA的表达和上调合成型标志蛋白OPN的表达，同时促进调节VSMCs表型转化的关键转录因子KLF4蛋白表达增加，表明Ang-Ⅱ诱导VSMCs表型转化。

氧化应激(oxidative stress)是指机体组织或细胞内氧自由基生成增加和(或)抗氧化应激能力降低，导致ROS在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。Rodriguez AI等[11]研究发现周期性拉伸的加强通过增加Nox1来源的ROS促进VSMCs由收缩型向合成型转化参与血管重构，表明Nox来源的ROS在VSMCs的表型转化中起重要作用。最近在VSMCs内发现的一种新型过氧化物酶即VPO1，类似于髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)，能催化Nox来源的H2O2(弱氧化剂)产生HOCl(强氧化剂)加剧氧化应激损伤，在调节VSMCs增殖、成骨样转化及参与自发性高血压大鼠的血管重构中起重要作用[7,12,13]。本课题结果发现在Ang-Ⅱ诱导VSMCs由收缩型向合成型转化过程中，Ang-Ⅱ呈浓度和时间依赖性升高VSMCs内VPO1表达，伴随着H2O2和HOCl的生成增加。沉默VPO1基因后能明显抑制Ang-Ⅱ诱导VSMCs收缩型标记蛋白SM22α、α-SMA表达的减少和OPN表达的升高，伴随着细胞内HOCl生成减少。基于VPO1通过催化H2O2生成HOCl起作用，予以HOCl培养VSMCs，同样发现SM22α、α-SMA蛋白表达减少，而OPN蛋白表达增加，表明VPO1/HOCl途径参与VSMCs的表型转化。

KLF4作为锌指结构核转录因子 KLFs 家族重要成员之一，在VSMCs表型转化中起重要的调节作[14,15]。本课题予以Ang-Ⅱ培养VSMCs诱导其表型转化，结果发现Ang-Ⅱ升高VSMCs内VPO1表达的同时上调KLF4蛋白表达。沉默VPO1基因后明显抑制Ang-Ⅱ诱导VSMCs内KFL4蛋白的升高，表明VPO1通过调节KLF4的表达参与VSMCs的表型转化。同样我们予以HOCl培养VSMCs，发现细胞内KLF4蛋白表达明显增加。

总之，本课题在体外实验发现Ang-Ⅱ诱导VSMCs表型转化伴随VPO1蛋白的表达升高，并通过VPO1/HOCl途径调节KLF4蛋白的表达在Ang-Ⅱ诱导VSMCs表型转化中起重要作用。

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