震荡法在纠正EDTA依赖的假性血小板减少中的应用

罗 磊， 朱建锋， 王蓓丽， 郭 玮， 潘柏申

复旦大学附属中山医院检验科，上海 200032

EDTA依赖的假性血小板减少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia，EDTA-PTCP)是一种由EDTA盐抗凝剂引起血小板聚集，导致血细胞自动分析仪不能有效识别，从而产生血小板计数结果明显低于正常值的现象[1]。EDTA-PTCP在门诊患者中发生率为0.09%～0.11%[2]，住院患者中约1.9%[3]。目前，检验科针对EDTA-PTCP的患者通常采用更换枸橼酸钠抗凝剂、添加氨基糖苷类药物或人工血小板计数的方法来进行复检。然而，这些方法比较耗时、费力，且更换抗凝剂和人工计数需要重复抽血，给患者造成了一定的痛苦。因此，本研究尝试采用更为简便的震荡法来解散EDTA引起的血小板聚集团簇，纠正EDTA-PTCP，以期获得可靠的血小板计数结果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年3月至2016年1月EDTA-PTCP患者140例。其中，男性68例，女性72例；年龄31～68岁，中位年龄为53岁。入组标准：血常规检测中仅血小板计数减少(<125×109/L)，其他参数均正常；仪器有报警提示血小板聚集，血涂片镜检确认存在聚集现象；更换枸橼酸钠抗凝剂能纠正。患者皮肤无紫癜，黏膜无出血，肝、脾、淋巴结未见肿大，除外其他引起血小板减少的疾病[4]。另随机选择20例血常规结果完全正常的标本作为对照。

1.2 仪器与材料 采用Sysmex XE-2100全自动血液分析仪及IKA○ RMS3圆周式震荡仪；Sysmex XE-2100全自动血液分析仪配套试剂、BD公司EDTA-K2及枸橼酸钠抗凝剂真空采血管；Sysmex XE-2100配套质控e-CHECKTM。

1.3 检测方法 EDTA-PTCP血标本及正常血标本用高速震荡仪以3 000 r/min(r=4.5 mm)震荡3 min后，立刻于Sysmex XE-2100全自动血液分析仪上再次检测，并制作血涂片2张用于显微镜下观察血小板分布情况。显微镜下观察时采用400倍高倍镜(物镜40倍×10倍目镜)，浏览血涂片尾部、双侧及血细胞分布均匀区域，至少观察10个视野，比较震荡前后血小板计数、红细胞计数、白细胞计数结果及血涂片中血小板分布情况。以镜检血小板分布情况作为判断血小板聚集是否解散的标准。所有标本在采集后30 min内完成首次检测，震荡后再次检测均在标本采集当天完成。

2 结 果

2.1 震荡前后血小板计数及聚集情况比较 140例EDTA-PTCP血标本震荡前后，血小板计数分别为(6～118)× 109/L、(13～376)× 109/L，中位数分别为 47× 109/L、162× 109/L。震荡法后镜检提示，93例完全解聚(图1、图2)、47例未完全解聚。

93例完全解聚标本震荡前后血小板计数差异有统计学意义(P<0.05)；47例未完全解聚标本震荡前后血小板计数差异无统计学意义(表1)。

图1 93例震荡后解聚EDTA-PTCP标本震荡前后血小板计数情况对比

图2 震荡后解聚EDTA-PTCP标本震荡前(A)、后(B)血涂片中血小板分布比较

标本数血小板计数(×109/L)范围中位数完全解聚(n=93) 震荡前6～11833 震荡后128～376184未完全解聚(n=47) 震荡前8～9039 震荡后13～14548

2.2 震荡前后红细胞计数、白细胞计数比较 140例EDTA-PTCP血标本震荡前后红细胞计数分别为(4.62 ± 0.41)× 1012/L、(4.70 ± 0.44)× 1012/L，白细胞计数分别为(6.49 ± 1.64)× 109/L、(6.56 ± 1.68)× 109/L，差异均无统计学意义。

2.3 正常血标本震荡前后比较 20例正常的血常规标本震荡前后血小板计数、红细胞计数、白细胞计数及血小板参数差异均无统计学意义。

表2 正常血标本震荡前后参数结果比较

PLT: 血小板计数；RBC：红细胞计数：WBC：白细胞计数；MPV：平均血小板体积；PDW：血小板分布宽度；PCT：血小板比积

3 讨 论

EDTA-K2抗凝剂是引起假性血小板计数降低的主要原因之一[5]，已经引起了检验科的高度重视。全自动血细胞分析仪以其快速、简便、精密度好和准确性高的优点被临床实验室广泛用于血液细胞计数分析。然而，由于血小板计数分析原理(阻抗法)的局限性，当血小板发生聚集时，体积远大于正常血小板，血细胞分析仪将其误认为白细胞计数，导致血小板计数结果假性降低，如不进行镜检确认和纠正，可能导致临床误诊，使患者接受不必要且有创性治疗，如输注血小板、按照免疫性血小板减少症进行激素治疗或进行骨髓穿刺术。

目前，检验科在遇到EDTA-PTCP患者时，通常采取的措施是重新采集经枸橼酸钠抗凝的血液标本进行检测或添加氨基糖苷类药物进行解聚。枸橼酸钠抗凝标本检测结果需要进行抗凝剂/血液标本体积校正。有文献[6]报道，枸橼酸钠抗凝血小板的稳定性随时间延长而降低，少数情况下使血小板发生聚集，造成假性血小板降低。而且重复采血不仅造成人力与时间的浪费，还会给患者带来痛苦。而添加氨基糖苷类药物后，血小板聚集解离需要约30 min。而且，不同患者对氨基糖苷类药物的敏感性不同，解聚效果不尽相同[7]，加之氨基糖苷类药物会导致白细胞分类检测通道溶血及染料结合效果不佳，从而导致分类计数结果不准确。

本研究尝试在避免重复抽血的基础上，采用震荡法快速处理EDTA-PTCP标本，对该方法用于纠正EDTA-PTCP的可行性进行了探讨。结果显示，93例(66.4%)标本完全解聚，提示震荡法能代替枸橼酸钠抗凝法用于EDTA-PTCP标本解聚。震荡法一定程度上减少了因重复抽血造成的人力与时间浪费以及给患者带来的痛苦，避免了临床上因误诊血小板减少而进行血小板输注等的发生。

本研究中，有47例(33.6%)EDTA-PTCP标本，震荡法无法将其聚集的血小板完全解散，可能与EDTA-PTCP的发生机制有关。目前，对于EDTA-PTCP的机制尚未明确，通常认为是一种免疫机制介导的现象，即体外血液中EDTA依赖性血小板自身抗体诱导血小板聚集。最早Pegels等[8]发现，血小板无力症(Glanzmann病)无此现象发生，因该病患者血小板膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa基因缺失，从而推测EDTA依赖性血小板自身抗体作用位点可能是GPⅡb/GPⅢa。研究[9]发现，发生EDTA-PTCP时，这种自身抗体主要作用于血GPⅡb。GPⅡb是一个Ca2+依赖蛋白质，在Ca2+存在时与GPⅢa 组成异源二聚体；当Ca2+浓度降低时，GPⅡb/Ⅲa二聚体解离，显露出GPⅡb上的隐性表位。EDTA依赖性血小板自身抗体可能通过作用于这一隐性表位而引起血小板聚集。但部分情况下结合不牢固，可通过震荡分散解离；对于无法震荡解离的标本，自身抗体可能介导了血小板的进一步活化并促进纤维蛋白的形成，进而促进聚集[10]。

综上所述，本研究证实，震荡法可使大部分EDTA-PTCP血标本血小板解聚，有助于获得准确的血小板计数结果，同时不影响其他血细胞参数，是一种简单、有效的方法。而对于震荡法无法纠正的标本，可再采取更换抗凝剂或添加氨基糖苷类药物等方法进行解聚。

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[ 9 ] VAN VLIET H H, KAPPERS-KLUNNE M C, ABELS J. Pseudothrombocytopenia: a cold autoantibody against platelet glycoprotein GP Ⅱb[J]. Br J Haematol, 1986, 62 (3): 501-511.

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