胃上皮细胞经亚硝基化合物MNNG短时刺激后细胞形态、功能特性的变化

蔡洁，王梅

(1江阴市人民医院，江苏江阴214400；2江苏大学医学院)

肿瘤是一个全球性的重大公共卫生问题，目前在中国乃至世界，恶性肿瘤仍旧是第二大死亡原因，且发病率还在不断上升[1]。胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国其新发病率已升至第2位，仅次于肺癌[2]。许多因素导致了胃癌的发生与发展，如饮食、吸烟、肥胖、环境、家族遗传以及慢性感染等都是主要的影响因素[3,4]。在中国，胃癌的发病率和病死率居高不下与中国人的饮食习惯息息相关，中国人偏爱腌制食品，而腌制品中含有大量致癌物质(如亚硝酰胺类化合物)，这是胃癌发生的关键因素[5]。N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种人工合成的亚硝基化合物(NOCs)，科研中经常用MNNG代替自然界中的亚硝酰胺类化合物来探究其在胃癌形成中的作用[6]。GES-1细胞系是永生化的胃上皮细胞系，是经SV40病毒转化人胃上皮细胞得到的，能在体外长期传代，因此被广泛用于胃上皮细胞恶性转化以及胃癌发生的相关研究中[7]。2014年3～ 8月，我们用MNNG短时刺激GES-1细胞，观察GES-1细胞形态和特性的变化，探讨其可能的原因，进一步了解MNNG在胃癌发生发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 GES-1细胞购自北京肿瘤防治研究所，化学致癌物MNNG(美国Sigma公司)；GAPDH抗体(中国康为公司)，E-cadherin抗体(美国Santa Cruz公司)，N-cadherin抗体(美国Abcam公司)，抗鼠Goat anti-mouse IgG (HRP，美国Santa Cruz公司)，抗兔Goat anti-rabbit IgG (HRP，美国Santa Cruz公司)，曝光液(美国Millipore公司)；RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶T+E(美国Sigma公司)，RIPA+PMSF(美国Vazyme公司)，二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司)，蛋白预染Marker(美国MBI公司)，结晶紫染料(中国艾然公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 将GES-1细胞接种于含10% FBS的RPMI1640培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，根据生长情况每隔2～3 d换培养液1次；当细胞融合度达到近80%时，按1∶3比例传代，然后继续培养。

1.2.2 MNNG短时刺激GES-1细胞 用适量DMSO溶解MNNG粉末，配成0.2 mol/L的MNNG溶液；用含10% FBS的RPMI1640培养液稀释MNNG溶液至1×10-5mol/L，滤器过滤。预先将适量的GES-1细胞种于6孔板中，培养24 h；加入1×10-5mol/L的MNNG溶液避光刺激0、4、8、12 h，接着撤去MNNG；用PBS缓冲液洗涤至少3次，用于后续实验。

1.2.3 细胞形态学观察 分别取GES-1细胞和经MNNG作用不同时间点的GES-1细胞，在倒置相差显微镜下观察细胞的形态，并拍照保存。

1.2.4 细胞增殖活性观察 采用平板克隆形成实验。将GES-1细胞和MNNG短时刺激的GES-1细胞消化计数，按1 000个细胞尽量均匀地种于直径3.5 cm细胞培养皿中；培养12 d后，PBS缓冲液洗涤至少3次；加4%多聚甲醛固定30 min，PBS缓冲液再洗涤3次；加结晶紫染色15 min，继续用PBS缓冲液洗涤干净；最后用照相机拍照，数出每个细胞培养皿中的细胞克隆数。实验至少重复3次。

1.2.5 细胞迁移能力观察 采用Transwell迁移实验。将GES-1细胞和MNNG短时刺激的GES-1细胞同时用胰酶消化，离心后用无血清RPMI1640培养液悬浮，计数后配成5×105/mL的细胞悬液。在24孔Transwell板下室加600 μL含10% FBS的RPMI1640营养液，上室内加入200 μL已配好的均匀细胞悬液，放入培养箱中培养12 h；取出上室，用4%多聚甲醛固定，棉签擦拭小室内未迁出的细胞；结晶紫染色15 min，PBS缓冲液洗净染液；在倒置显微镜的低倍镜下拍照，每孔随机拍摄6个视野，计数每个视野的细胞。实验至少重复3次。以穿膜细胞数表示细胞迁移能力，数量越多迁移能力越强。

1.2.6 细胞中上皮-间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin和N-cadherin检测 采用Western blotting法。收集GES-1细胞和经MNNG作用不同时间点的GES-1细胞，离心后弃去上清；在细胞沉淀中加入适量蛋白裂解液RIPA和蛋白酶抑制剂PMSF(250∶1)，每5 min在振荡器上剧烈震荡1 min，共5次；置于预先预冷至4 ℃的高速离心机中，以12 000 r/min离心15 min；吸取上清液并记录其具体体积，用核酸蛋白测定仪检测每组上清的总蛋白浓度。再向上清中加入是其总体积1/4的Loading Buffer，混匀，沸水煮5 min，使蛋白变性。配置8%的聚丙烯酰胺凝胶，根据所测各组蛋白的浓度，计算出上样体积；按顺序加样后，恒压电泳，恒流转膜2 h，封闭1 h；用特异性单克隆抗体(E-cadherin、N-cadherin和GAPDH)孵育，4 ℃过夜。次日，用TBST洗膜液洗膜，孵育二抗；GAPDH用HRP标记抗鼠二抗孵育，E-cadherin和N-cadherin用HRP标记的抗兔二抗；37 ℃孵育1 h，再洗膜。最后，以曝光液为介质，用化学发光成像系统成像，保存图片；用Photoshop分析条带的灰度值，以灰度值大小来表示蛋白的相对表达量。实验至少重复3次。

2 结果

2.1 MNNG短时刺激对GES-1细胞形态的影响 与正常GES-1细胞相比，MNNG刺激后的细胞更大，更扁平，边缘不清晰，形状不一，有些细胞成团块状生长；并且随着刺激时间的延长，部分细胞呈纺锤形或不规则形，比未刺激细胞更加细长。

2.2 MNNG短时刺激对GES-1细胞增殖能力的影响 GES-1细胞经MNNG刺激0、4、8、12 h时，其克隆数分别为(82.00±1.16)、(89.67±3.28)、(81.33±1.76)、(85.67±1.45)个，各时点GES-1细胞克隆数比较差异无统计学意义。

2.3 MNNG短时刺激对GES-1细胞迁移能力的影响 GES-1细胞经MNNG刺激0、4、8、12 h时，其穿膜细胞数分别为(83.00±2.89)、(149.00±5.20)、(265.70±6.06)、(491.00±8.74)个，刺激时间越长穿膜细胞数越多(P均<0.05)。

2.4 MNNG短时刺激对GES-1细胞E-cadherin、N-cadherin表达的影响 随着MNNG刺激时间延长，GES-1细胞E-cadherin表达逐渐降低而N-cadherin表达逐渐升高(P均<0.05)。见表1。

表1 MNNG短时刺激对GES-1细胞E-cadherin、N-cadherin表达的影响

注：与刺激0 h时相比,*P<0.05。

3 讨论

研究认为，胃癌的病因非常复杂，至今其发生的具体病因和相关机制仍不清楚，但饮食习惯一定是一个相当重要的影响因素。NOCs被认为是强有力的致癌物质，也是胃癌发生的重要危险因素之一，人工合成的MNNG是NOCs中典型的代表。在国内外的实验研究中，该化合物是常用于动物模型的诱导剂和致癌物，并已成功用MNNG在动物体内建立胃癌模型[6]。研究[8]发现，将一定浓度的MNNG避光作用于GES-1细胞，24 h后撤去MNNG溶液，这样高浓度长时间受刺激的GES-1细胞发生大量死亡，少量残存的细胞继续培养增殖，成为经MNNG诱导恶性转化后GES-1细胞株，即MC细胞株。MC细胞常被作为胃癌癌前病变细胞的体外模型，被广泛用于胃癌发生机制的研究[9]。但是，在实际生活或模拟实验中，一次性接受高浓度、长时间NOCs刺激的可能性比较小，通常都是低浓度短时间的刺激，而这类研究并不多。所以，本研究降低了MNNG浓度和刺激时间，侧重于低浓度短时处理GES-1细胞。在该浓度和时间作用下，GES-1细胞的活性基本不受影响，胞体变大扁平，轮廓不清，周边多呈毛刺状；有些细胞两端变细长，甚至呈纺锤形；大部分细胞生长无序，排列紊乱，成团块状生长，有类似肿瘤细胞的生长和形态学特点。但是，通过平板克隆实验，比较刺激后的GES-1细胞与正常GES-1细胞的增殖能力，发现并无明显差别。这可能是因为刺激力度有限，还未达到影响细胞增殖能力的程度。以上结果表明，低浓度短时MNNG刺激的GES-1细胞形态发生了一定变化，有恶性转化的趋势，但是其增殖能力还未有显著变化。

EMT是指在特定的生理或病理条件下，上皮细胞向间质细胞转化的现象[10]。在此过程中，上皮细胞发生质变，细胞失去极性，细胞间黏附性减弱，但获得能动性和侵袭性[11]。EMT表型的获得可促进细胞的迁移，破坏上皮样结构体系，是肿瘤发生发展乃至肿瘤干性获取的重要特征[12]。因此，EMT的异常活化在许多肿瘤的发生、侵袭和转移中起关键作用，如胃癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等。有报道[13]称，MNNG预处理的GES-1细胞和MC细胞形态向间质样变化，且迁移能力增强；经CCl2刺激后变化加剧，且获得了EMT表型。本研究结果显示，经MNNG低浓度短时刺激的GES-1细胞迁移能力增强，再结合考虑细胞形态学的变化，大胆提出MNNG使GES-1细胞发生了EMT转化的假设。

在EMT转化过程中,E-cadherin是关键的传递者，能通过加强细胞间黏附性来维持细胞极性并且组织上皮细胞排列[14]，还参与细胞内信号传递，从而控制细胞成熟、分化、生长和能动性，故而可作为侵袭抑制基因。EMT异常活化会使E-cadherin表达下调，而向间质样蛋白N-cadherin转化;N-cadherin在EMT过程中表达上调[14]，其依赖于细胞环境，促进黏附和迁移；但这两种特性受N-cadherin基因的不同部位调控，故而是相互独立的。本研究结果显示，MNNG短时刺激GES-1细胞后，细胞E-cadherin表达骤减，而N-cadherin表达急剧升高。这与假设相符，本研究所结果表明MNNG的确使GES-1细胞发生了EMT。

越来越多的证据显示，肿瘤的各级进程都可能触发EMT表型；胃癌的发生及其恶性特征就与E-cadherin突变相关，而N-cadherin表达与侵袭性胃癌相关[15]，通过抑制EMT转化能增强化疗药物的疗效[16]。因此，EMT在肿瘤发生、转移、耐药、预后以及复发等阶段都起到关键作用。目前，引起肿瘤进程中EMT发生的机制有很多，比较被认可的是细胞因子发挥关键性作用，细胞因子通过调节转录因子的表达或者激活各种信号通路来诱导EMT发生。前列腺癌细胞受可溶性因子人胰岛素样生长因子(IGF1)刺激后，细胞中转录因子E盒结合锌指蛋白(ZEB1)表达上调，从而引起EMT转化[17]。白细胞介素6和转化生长因子β通过上调转录因子Snail和p-Smad3，同时活化JAK/STAT3通路来增强肺癌中EMT转化[18]。另外，Wnt/β-catenin信号通路和PI3K/AKT信号通路在胃癌的EMT发生中也扮演重要角色[15]。本研究中MNNG促使胃上皮细胞发生EMT转化的机制还不清楚，今后也可以从细胞因子或转录因子着手进行下一步研究。

综上所述，本研究发现化学致癌物MNNG短时刺激胃上皮细胞后，胃上皮细胞形态发生明显变化，细胞迁移能力增强，并且发生EMT转化，但诱导EMT发生的具体原因和机制还不清楚，这是今后需继续探索和研究的方向。

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