长期有氧运动对老年大鼠主动脉中Nrf2介导的抗氧化通路的影响

王 兵 张燕晓 谷 崎

(西安工业大学体育学院，陕西 西安 710032)

血管老化是诸多心血管疾病发病过程中的一个重要风险因子〔1〕，涉及一系列复杂的血管系统结构和功能的改变〔2〕。研究发现有氧运动可以增强心血管适应性并减轻衰老相关的动脉硬化和血管内皮功能失调〔3～7〕。然而其中的分子机制尚未得到完全阐明。研究表明氧化应激随着衰老的过程在血管系统中越来越严重〔8，9〕。氧化应激可以导致内皮损伤并促进粥样硬化性血管疾病包括心肌缺血、脑卒中、血管性痴呆〔10〕。氧化应激指的是体内抗氧化系统和活性氧(ROS)生成之间平衡的失调。血管中ROS的生成主要由NADPH氧化酶催化、线粒体电子传递链及一氧化氮合酶(NOS)失耦联过程中生成；而抗氧化系统主要由一些抗氧化活性物质(如硫化氢、谷胱甘肽等)及一些抗氧化酶系统组成。本文探讨长期有氧运动对老年大鼠主动脉中核因子E2相关因子(Nrf)2介导的抗氧化通路的影响。

1 资料与方法

1.1动物和试剂 雄性Fisher 344×Brown Norway大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，上海)，RIPA裂解液(上海碧云天生物科技公司，上海)，RT-PCR试剂盒(Roche罗氏生物试剂，上海)，三氯甲烷、异丙醇、乙醇、甲醇等(中国医药集团上海化学试剂公司，上海)，羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒(上海闳巨实业有限公司，上海)，组织柠檬酸合成酶活性比色法定量检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司，上海)。

1.2动物与分组 23月龄大鼠随机分为运动组和非运动组，2月龄大鼠作为对照组，每组14只。运动组大鼠适应性喂养1 w；第1周适应性游泳运动，每次进行60 min的无负重游泳运动，每2天增加10 min，持续6天；第2周开始，每天进行90 min的无负重游泳运动。每周6 d。持续运动12 w。水深0.50 m；水温(31±3)℃。时间安排在每天的上午九点左右开始进行。实验结束后，平均动脉压(MAP)通过尾动脉测压法得到；血糖通过全生化检测仪检测而得；分离比目鱼肌，应用“组织柠檬酸合成酶活性比色法定量检测试剂盒”检测柠檬酸合成酶考察运动的效果。

1.3苏木素-伊红(HE)染色 主动脉标本，4%中性甲醛中固定过夜，去离子水冲洗。脱水过程：75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇依次脱水。透明过程：二甲苯分3次处理。液体石蜡(56℃～58℃)包埋。主动脉横断面切片(5 μm)，60℃烤片。脱蜡至水过程：切片二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次处理。苏木素染色5～10 min，1%盐酸酒精溶液分化，50℃～60℃温水5～10 min显蓝，伊红复染大约2 min。干燥透明过程：95%酒精、无水乙醇、二甲苯依次处理；中性树脂封固，镜下观察并拍照。

1.4HYP检测 取大鼠主动脉组织，按照试剂盒说明书进行HYP含量的测定；组织称重并剪碎，加入水解液1 ml，混匀；加盖后，置于水浴锅中，沸水浴加热水解20 min(期间混匀2～3次，保证水解充分)；用NaOH将pH值调至6.5左右。根据试剂盒加入各种检测试剂，涡旋混匀；置于水浴锅中60℃加热15 min，冰上冷却后1 000 r/min离心10 min分离上清液，分光光度计在550 nm处检测吸光度值；用HYP标准品绘制标准曲线计算样品中的浓度。

1.5内皮功能检测 取各组大鼠胸主动脉，将主动脉切成5 mm宽分段，放入含有20 ml Kerbs液浴槽。同时给予95%O2和5%CO2混合气体，首先将静息张力稳定在2 g，随后加入新福林3×10-7mol/L预收缩，待达到最大收缩反应时，加入梯度浓度乙酰胆碱(1 nmol/L～10 μmol/L)，观察其对血管平滑肌的舒张反应。

1.6Western印迹分析 组织蛋白提取：RIPA裂解液使用前加入1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF，0.5 mmol/L EDTA和蛋白酶抑制剂，主动脉剪碎，加入0.5 ml组织裂解液，电动匀浆；4℃ 22 500 r/min离心10 min，收集上清，后再离心1次，取上清。Bradford法测蛋白浓度检测上清液蛋白含量。按蛋白含量添加4倍上样缓冲液，调整蛋白量浓度到合适范围，100℃水浴锅中加热10 min变性蛋白质，分装后-80℃保存。制胶，每孔加入20 μg蛋白溶液，60 V电泳0.5 h，120 V电泳待待测蛋白到达合适位置为止。100 V湿法电转膜；加丽春红染色观察蛋白条带，考察转膜效果；PVDF膜印迹显色；10%脱脂奶粉封闭非特异性免疫反应结合位点；加入一抗，4℃条件下孵育过夜；加入二抗，室温孵育2 h；加入电子发光(ECL)底物，用保鲜膜包裹，平放于X光片曝光盒；曝光，制片；高像素扫描仪扫描目的条带，Bandscan软件进行灰度值定量，以GAPDH蛋白作为内参蛋白校正最终结果。

1.7RT-PCR 主动脉组织剪碎，Trizol法提取总RNA，依次通过三氯甲烷、异丙醇、乙醇分离出总RNA。逆转录反应得到单链DNA；利用SYBRGreen I染料在MJ Research Option2荧光定量PCR仪上检测NAPDH醌氧化还原酶(NQO)1、谷氨酸半胱氨酸连接(GCLC)、血红素加氧酶(HMOX)-1的表达。引物序列：HMOX-1正义链5′TTG TCT CTC TGG AAT GGA AGG3′,反义链5′CTC TAC CGA CCA TTC TG3′;NQO1正义链5′TGG GAT ATG AAT CAG GGA GAG3′,反义链5′GAG AGG TAA CTA ATA GCA ACA AG3′;GCLC正义链5′GCT TTC TCC TAC CTG TTT CTT G3′,反义链5′TGG CAG AGT TCA GTT CCG3′;GAPDH正义链5′GAG CTG AAT GGG AAG CTCA C3′,反义链5′AAA GGT GGA GGA GTG GGA GT3′。反应体系是：10倍PCR缓冲液2.5 μl，4 μl的MgCl2(25 mmol/L)，1 μl dNTP(10 mmol/L)，0.5 μl 20×SYBR Green，1 μl引物(12.5 mmol/L)，0.3 μl的Taq DNA聚合酶 (1.5 U)，1 μl cDNA，加去离子水补足，使体系的总体积为25 μl。反应程序为：94℃ 5 min预变性，然后是40个循环反应(94℃ 30 s变性，56℃ 30 s退火，72℃ 45 s延伸)，4℃ 1 h结束。记录CT值，GAPDH作为内参基因校正最终结果。

1.8二氢乙啶(DHE)染色 DHE可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的活性氧氧化，继而形成氧化乙啶；氧化乙啶可与染色体DNA结合并产生红色荧光。胸主动脉冰冻包埋并切片5 μm，10 μmol/L的DHE溶液37℃避光孵育0.5 h。荧光显微镜下观察红色荧光并拍照。组织的荧光强度通过ImageJ软件分析。

1.9统计学方法 采用SPSS12.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1长期有氧运动对老年大鼠一般状态的影响 与对照组大鼠相比，老年大鼠体重和血压明显增加，肌肉中柠檬酸合酶活性和血糖浓度变化不明显。老年大鼠经过长期有氧运动后，体重明显下降，肌肉中柠檬酸合酶活性增加，MAP降低(均P<0.05)，而血糖浓度变化不明显(P>0.05)。见表1。

表1 长期有氧运动对老年大鼠一般指标的影响

与对照组比较：1)P<0.05，与非运动组比较：2)P<0.05，下表同

2.2长期有氧运动对老年大鼠主动脉功能的影响 与对照组大鼠相比，老年大鼠主动脉厚度/长度比值明显增加，主动脉厚度明显增加，提示老年大鼠的主动脉出现增厚；HYP含量明显增加，提示老年大鼠的主动脉中纤维含量明显增加(均P<0.05)；老年大鼠主动脉对乙酰胆碱刺激引起的内膜依赖的舒张反应明显减弱，提示老年大鼠主动脉内皮功能的下降。老年大鼠经过长期有氧运动后，主动脉厚度/长度比值和主动脉厚度下降，HYP含量减少，主动脉对乙酰胆碱刺激引起的内膜依赖的舒张反应明显增强，提示长期有氧运动可以减轻年老大鼠主动脉肥厚、纤维化及内皮功能下降。见图1，表2。

2.3长期有氧运动上调老年大鼠主动脉Nrf2通路 与对照组大鼠相比，老年大鼠主动脉中Nrf2蛋白表达明显减少，NQO1、GCLC、HMOX-1 mRNA水平明显降低，提示老年大鼠主动脉中Nrf2介导的抗氧化通路明显下调。老年大鼠经过长期有氧运动后，主动脉中Nrf2蛋白表达增加，NQO1、GCLC、HMOX-1 mRNA水平明显增加，提示长期有氧运动可以激活老年大鼠主动脉中Nrf2介导的抗氧化系统。见图2，表3。

图1 各组大鼠主动脉病理学观察(HE，×100)

表2 长期有氧运动对老年大鼠主动脉功能的影响

图2 各组大鼠主动脉Nrf2蛋白表达

表3 长期有氧运动对老年大鼠主动脉中Nrf2通路的影响

2.4长期有氧运动抑制老年大鼠主动脉中ROS生成 与对照组大鼠相比，老年大鼠主动脉DHE染色的荧光强度明显增加，提示老年大鼠主动脉中ROS生成明显增加，发生了明显的氧化应激；长期有氧运动后，老年大鼠主动脉DHE染色的荧光强度明显降低，提示长期有氧运动可以减轻老年大鼠主动脉中氧化应激的发生。见图3。

图3 各组大鼠主动脉DHE染色(DHE，×100)

3 讨 论

本课题的研究发现Nrf2蛋白在老年大鼠主动脉中表达下调。Nrf2蛋白是调控细胞和组织内抗氧化系统的重要因子，在机体各器官系统中均有表达。Nrf2蛋白在核定位因子介导帮助下进入细胞核，该蛋白的Neh1结构域与细胞核内的Maf蛋白结合，接着又与抗氧化反应元件(ARE)结构域结合，在Neh4和Neh5结构域的协助下与cAMP反应元件结合蛋白(CREB)结合，最终启动ARE结构域调控的下游基因转录〔11〕。我们已知的Nrf2下游基因达到上百种，其中与氧化应激相关的抗氧化类蛋白有GCLC、硫氧还原酶、硫氧还蛋白还原酶、半胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、HMOX-1，过氧化物歧化酶、NQO1、半胱甘肽巯基转移酶、UDP葡糖醛酸基转移酶等〔12〕。本研究发现GCLC、HMOX-1、NQO1 mRNA表达在老年大鼠主动脉中表达也发生了明显下调。在年轻动物的细胞中，ROS的过度生成可以负反馈性地激活Nrf2/ARE抗氧化通路。然而在老年大鼠的血管中，过度生成的ROS无法激活Nrf2/ARE抗氧化通路，从而使得老年大鼠的血管面对ROS的损伤更加敏感〔13〕。因此衰老破坏了负反馈循环中Nrf2的功能，从而加剧了衰老过程中ROS诱导的氧化应激损伤。

在血管平滑肌细胞中高表达Nrf2蛋白可以抑制血管平滑肌细胞增殖，对抗氧化性低密度脂蛋白诱导的损伤〔14〕。在血管内皮细胞中高表达Nrf2可以对抗过氧化氢(H2O2)诱导的细胞毒作用并抑制肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)-1β诱导的巨噬细胞超化因子(MCP)-1和血管细胞间黏附分子(VCAM)1的表达〔15〕。在动脉粥样硬化模型中，Nrf2蛋白的缺失可以通过抑制HMOX-1的表达从而加剧病变的发生〔16，17〕，提示在血管中Nrf2及其下游的抗氧化通路对血管保护具有重要意义。

运动对Nrf2/ARE通路的调节作用近年研究越来越多。短期的运动(1 h左右)对Nrf2的影响并不明显；而较长时间的运动(6 h左右)就会明显激活骨骼肌内的Nrf2/ARE通路〔18〕。本研究显示长期有规律的有氧运动可以恢复主动脉中Nrf2的蛋白表达，从而提高其下游的抗氧化通路，这对于解释长期有氧运动在老年人群中的血管保护作用具有重要意义。

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