重组腺病毒p21转染人毛乳头细胞的模型构建

张国强 易 娟 赵 璐 程 毅 高顺强

(河北医科大学第四医院皮肤科，河北 石家庄 050011)

人毛乳头细胞(HDPCs)具有一定的毛发诱导能力〔1〕，对毛发生长及周期循环起到至关重要的作用。而体外培养的DPCs呈现凝集性生长是其主要生物学特性之一〔2〕，这可能和细胞衰老有关。p21(又名细胞周期蛋白激酶抑制因子，CDKN1A)是众多衰老相关基因之一〔3〕，参与调节细胞衰老的许多过程。本实验拟以腺病毒rAd5-CDKN1A成功转染DPCs，沉默DPCs中p21基因，确定转染的转染效率及最佳滴度，以进一步研究p21基因对DPCs生物学特性的影响。

1 材料与方法

1.1细胞及主要试剂 HDPCs(货号：2400，批号：9640)购自美国ScienCell公司，间充质干细胞(MSCM)培养基(货号：7501，批号11626)购自美国 ScienCell公司，腺病毒rAd5-CDKN1A-1p2 shRNA(批号：13079)和rAd5-HKshRNA-EGFP(批号：130725-3)购自武汉淅玛生物有限公司，兔抗人p21单克隆抗体(货号：2990-1，批号:YJ102911CS)购自 EPITOMICS公司，总RNA抽提试剂盒(Trizol)购自Solarbio公司，莫洛尼质鼠白血病病毒(M-MLV)反转录试剂盒(批号8213068)及聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(批号8211212)均购自Invitrogen公司。免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2倒置荧光显微镜下测定rAd5-CDKN1A对DPCs转染效率 取对数生长期生长状态较好的DPCs，制成单细胞悬液后以每孔1×105个/ml的浓度接种于2个6孔板中，待细胞完全贴壁后，分别用rAd5-CDKN1A病毒液转染DPCs，感染系数(MOI)分别为0、25、50、200、500〔4〕,于48 h后荧光显微镜下每孔分别随机选择3个200倍视野计数呈现绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞数，并在明场中计数该视野内细胞总数，计算转染率(转染率=GFP阳性细胞数/明场下该视野内总细胞数)。

1.33-(4,5-二甲基噻噻-2)-2,5二苯基四氮唑溴盐(MTT)法检测不同浓度rAd5-CDKN1A和rAd5-HK下DPCs的增殖效率 取对数生长期生长状态良好的DPCs制成单细胞悬液，以每孔按1×105个/ml的浓度接种于96孔板。代细胞完全贴壁后，按MOI值为0、25、50、100、200、500加入腺病毒，并设置相应MOI值组，其中以完全培养液为空白对照，每组设立6个平行孔，分别于指定时间(24、48、72、96、120、144 h)弃去培养液，用MTT的方法进行检测，计算细胞增殖效率。

1.4RT-PCR方法检测rAd5-CDKN1A和rAd5-HK转染DPCs后p21基因的表达 收集生长良好的DPCs，按MOI=100分别转染rAd5-CDKN1A和rAd5-HK入DPCs，并收集相应细胞提取mRNA，按M-MLV反转录试剂盒和PCR扩增试剂盒说明进行反转录和RT-PCT扩增，其中p21引物由Invitrogen公司合成，引物A：5'-ATTCAGCATTGTGGGAGGAG-3'，引物B：5'-TGGACTGTTTTCTCTCGGCT-3'，β-actin 引物也由Invitrogen公司合成，引物A：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，引物B：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。于PCR Pχ2Thermal Cycler机子上设置循环程序为95℃，30 s；47℃，30 s；72℃，20 s；35个循环。之后再以1.5%琼脂糖凝胶电泳实验检测p21基因表达，用凝胶成像分析系统分析电泳结果。

1.5统计学方法 采用SPSS16.0软件进行t检验，χ2检验，单因素方差分析。

2 结 果

2.1rAd5-CDKN1A和rAd5-HK对DPCs的转染效率 DPCs细胞对腺病毒较敏感，随着MOI的增加，染色阳性率也增加。当MOI取值为0、25、50、100、200和500时，转染效率分别为0、(15.2±2.64)%、(44.3±3.95)%、(95.2±1.06)%、(97.5±1.07)%和(98.9±0.67)%。MOI为0、25、50及100组中各组间差异有统计学意义(P<0.05)，而MOI为100、200和500组间差异无统计学意义(P>0.05)；MOI为0、25、50和100组显示腺病毒的转染效率与病毒浓度呈明显正相关(r=0.967，P<0.01；Y=0.978 1，X-4.126 7)，然而随着病毒浓度的进一步增加，即MOI值为100、200和500时，转染效率升高不明显(r=0.382，P>0.05)。此外，于MOI=200和MOI=500组的视野中，可见小部分细胞漂浮，且MOI=500组细胞漂浮较多，见图1。

图1 不同MOI值的重组腺病毒rAd5-CDKN1A shRNA转染DPCs GFP的观察结果(×200)

2.2rAd5-CDKN1A转染DPCs对细胞增殖抑制的影响 随着腺病毒rAd5-CDKN1A浓度增加，各实验组与相同时间点对照组相比，细胞增殖逐渐受到抑制，其中，MOI=200及MOI=500组对DPCs细胞的增殖抑制效果明显；而MOI=100组对DPCs细胞的增殖促进效果显著(P<0.05)，MOI=25和MOI=50组对DPCs细胞增殖无明显作用，见图2。

图2 不同MOI值下DPCs的生长曲线

2.3rAd5-CDKN1A转染DPCs对细胞内p21基因mRNA表达的影响 以MOI=100为理想滴度将rAd5-CDKN1A shRNA和rAd5-HK shRNA导入DPCs中，并提取相应RNA进行反转录、RT-PCR扩增及凝胶电泳分析(以正常细胞为基准，将转染rAd5-HK shRNA的细胞作为空载体对照)。发现rAd5-CDKN1AshRNA处理后的DPCs中p21基因条带明显暗于正常细胞和转染rAd5-HK shRNA的细胞，见图3。

1：rAd5-CDKN1A shRNA,2:rAd5-HK shRNA,3:正常细胞图3 正常细胞、转染rAd5-HK shRNA和rAd5-CDKN1A shRNA细胞中P21基因表达

3 讨 论

DPCs位于毛囊基底部，具有毛发诱导能力，可诱导毛囊形成并在毛发生长、周期性循环及再生中发挥主导作用〔5,6〕。此外，体外培养早期DPCs展现出凝集性生长特性，但体外培养高代次DPCs并不展现这一特性，反而出现生长抑制。有学者认为DPCs凝集性生长特性可能与DPCs的生物学功能有关〔7〕。高代次DPCs逐渐丧失凝集性生长特性可能与细胞衰老有关。而细胞衰老是由细胞周期蛋白激酶抑制因子调控，其中，细胞周期蛋白激酶抑制剂p21也是一种抑癌基因，其在预防肿瘤的发展中起到至关重要的作用，并对细胞衰老起到一定的调控作用。

腺病毒主要是通过细胞表面的特异性受体柯萨奇病毒受体进入细胞，不同类型细胞对腺病毒易感性不同，其易感能力取决于细胞表面作用受体数目的多少〔4〕。腺病毒早期基因(E1)缺失的腺病毒载体本身没有复制能力，但当剂量过大或转染时间过长时，腺病毒对感染细胞却有一定的毒性〔4〕。这限制了目的基因表达的时间和水平，因此，在涉及腺病毒转染的体内外实验研究中，确定最佳MOI便是所有实验最重要的前提。腺病毒细胞毒性与MOI感染时间呈明显的对应关系〔4,8〕，尤其是MOI达到500以上时，细胞毒性和目的基因表达下降都有明显的表现，但MOI低于50时，腺病毒对细胞增殖无明显影响〔4,9〕。相关文献指出，异常超表达的p21可引起细胞生长阻滞，且基因沉默p21大都对细胞增殖有促进作用〔10〕。而另一方面，腺病毒本身对细胞有一定的毒副作用，转染过程中，腺病毒的进入对细胞也是一种外源性刺激，可能引起细胞一系列的干扰反应，使细胞停滞，生理特性发生改变如部分细胞漂浮等。因此，在腺病毒滴度不合适时，转染rAd5-CDKN1A对DPCs的作用可能主要是干扰反应，合适滴度的rAd5-CDKN1A才有可能体现出沉默目的基因p21的作用。细胞部分漂浮可能是由于病毒滴度较大，产生的毒素较多，影响细胞生长状态造成。MTT法绘制转染后DPCs的增殖曲线提示rAd5-CDKN1A对DPCs的增殖有促进作用，符合相关文献中p21沉默往往促进细胞增殖的报道〔10〕。基于腺病毒转染的细胞毒副作用及促进细胞增殖两方面考虑，我们选择MOI=100为rAd5-CDKN1A shRNA转染DPCs的理想滴度。既保证较高的转染效率，又不至于因腺病毒本身对细胞毒性作用而干扰实验结果。为将来研究p21对DPCs生物学特性的影响奠定了基础。

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3Gledhill K,Gardner A,Jahoda CA.Isolation and establishment of hair follicle dermal papilla cell cultures〔J〕.Methods Mol Biol,2013;989:285-92.

4徐 波，张松涛，李龙江,等.重组腺病毒p53转染口腔黏膜异常增生的实验研究〔J〕.华西口腔医学杂志，2009;27(2)：122-5.

5Ohyama M,Zheng Y,Paus R,etal.The mesenchymal component of hair follicle neogenesis:background,methods and molecular characterization〔J〕.Exp Dermatol,2010;19(2):89-99.

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7Yamao M,Inamatsu M,Ogawa Y,etal.Contact between dermal papilla cells and dermal sheath cells enhances the ability of DPCs to induce hair growth〔J〕.J Invest Dermatol,2010;130(12):2707-18.

8Frey BM,Hackett NR,Bergelson JM,etal.High-efficiency gene transfer into ex vivo expanded human hematopoietic progenitors and precursor cells by adenovirus vectors〔J〕.J Blood,1998;91(8):2781-92.

9Lou J,Xu F,Merkel K,etal.Gene therapy:adenovirus-mediated human bone morphogenetic protein-2 gene transfer induces mesenchymal progenitor cell proliferation and differentiation in vivo and bone formation in vivo〔J〕.J Orthop Res,1999;17(1):43-50.

10Gartel AL,Radhakrishnan SK.Lost in transcription:p21 repression,mechanisms and consequences〔J〕.Cancer Res,2005;65(10):3980-5.