老年耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药机制及院内高毒力荚膜基因型分布特点

冯晓静 刘 娟 段少华 朱 静 王晓利

(承德市中心医院医院感染管理科，河北 承德 067000)

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌多见于医院获得性感染，老年人因免疫力下降属于易感人群，治疗预后很差〔1〕。该领域研究者已报道，在无肝胆病史患者中发现了肺炎克雷伯菌性肝脓肿，并发生转移感染，因该类菌株的生物学特性和致病能力与普通肺炎克雷伯菌存在差异，因此定义为高毒力肺炎克雷伯菌〔2〕。肺炎克雷伯菌毒力增强与荚膜多糖、毒力基因有关，包含78种以上的荚膜血清型，毒力最强的为K1、K2，是毒力决定元素〔3〕。目前对多重耐药的高毒力肺炎克雷伯菌研究较少，特别是耐碳青霉烯的高毒力肺炎克雷伯菌。相关研究显示，碳青霉烯酶Kpc基因转入K2荚膜型肺炎克雷伯菌后对碳青霉烯类药物耐药〔4〕。本研究旨在探讨老年患者中分离的18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的耐药机制和毒力基因情况。

1 材料与方法

1.1材料 收集2016年1月至2017年3月承德市中心医院收治的老年患者中分离出的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌18株，剔除同一患者相同部位的重复样本，男11例，女7例；样本类型：痰液8份，血液、尿液、导管各2份，胆汁、咽拭子、肺泡灌洗液、伤口分泌物各1份。

1.2菌株鉴定和药敏试验 常规行细菌接种培养纯化后，使用Phoenix 100全自动微生物鉴定仪对菌株进行鉴定；采用K-B法检测美罗培南、头孢哌酮-舒巴坦药敏，MTS法测定替加环素药敏，碳青霉烯药敏采用亚胺培南纸片复筛。

1.3碳青霉烯酶表型试验 (1)改良Hodge试验：配置大肠埃希氏菌NCTC12900悬液，培养液10倍稀释后接种到M-H琼脂平皿，干燥后加入美罗培南纸片，取4～5个待测菌落接种到纸片边缘，35℃孵育18～20 h后观察。(2)EDTA协同试验：将待测菌悬液涂于M-H平皿上，干燥后贴亚胺培南纸片，取其中一张滴加20 μl 1.0 mmol/L的乙二胺四乙酸溶液，第二张不滴加任何试剂，在35℃环境中静置22～24 h，测量纸片间的抑菌环差值，>5 mm为阳性。(3)Carba NP试验：依据2016年美国临床与实验室标准化协会制定的药敏试验标准，检测产碳青霉烯酶情况，并进行分类。

1.4毒力表型试验 (1)拉丝试验：待测菌株接种到血清琼脂平板，在27℃环境中静置24 h后，用接种环挑取菌种在培养基上划线，当黏液丝长度≥5 mm为阳性。(2)生物被膜形成试验：调整肺炎克雷伯菌浓度为1×106CFU/ml，96孔板中每孔分别加入100 μl菌液，常规孵育24 h，每孔加入30 μl结晶紫，混匀后孵育20 min，洗涤后上酶标仪读取590 nm处吸光度，OD值>0.5为高产生物被膜，0.1～0.5为中产生物被膜，<0.1为低产生物被膜。(3)血清杀伤敏感性试验：吸取1×106CFU/ml 30 μl菌液加入80 μl健康体检者2 ml血清中，分别于0、60、120、180 min移去一半细菌悬液，MH肉汤稀释10倍，20 μl接种到MH平板，孵育20～24 h后判读结果。

1.5耐药基因、高毒力荚膜血清型及基因检测 PCR检测耐药基因分布情况，包括碳青霉烯基因(Kpc、Imp、Vim等)、超广谱β-内酰胺酶基因(Tem、Shv、Ctx-M)、AmpC酶基因(DHA)，膜孔蛋白编码基因(Ompk35、36)。高毒力荚膜血清型(K1、K2、K5等)；毒力基因(rmpA、Acrobactin、FimH-1)。操作步骤：煮沸法制备菌株DNA模板，PCR引物序列由北京天恩泽生物技术有限公司生产。反应体系20 μl：dNTP 2 μl、Taq DNA聚合酶3 μl、10×Buffer 3 μl、上下游引物各1 μl、cDNA 1 μl、双蒸馏水9 μl。反应条件：94℃ 2 min、94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 45 s，共40个循环。扩增产物电泳后分析各条带。

1.6统计学分析 使用SPSS19.0软件行χ2检验。

2 结 果

2.1碳青霉烯酶表型试验结果 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中改良Hodge试验阳性9株，弱阳性1株，见图1A；EDTA协同试验阳性10株，见图1B；18株Carba NP试验均为产酶菌，A类酶10株，同时产A类、B类或D类酶8株。

2.2耐药基因和膜孔蛋白检测结果 Kpc、Ndm、Tem、Shv、Ctx-M、Dha基因在相应的位置均出现条带，但Imp、Sim、Vim、Oxa-48基因未出现条带。18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶检出Kpc基因6株(33.33%)，Ndm基因7株(38.89%)；超广谱β-内酰胺酶中Shv检出15株(83.33%)，明显高于Ctx-M基因10株(55.56%)、Tem基因7株(38.89%)(P<0.01)；AmpC酶中检出DHA基因2株(11.11%)；见图2。膜孔蛋白基因PCR电泳显示，Ompk35编码基因缺失7株(38.89%)，Ompk36缺失10株(55.56%)，Ompk36编码基因缺失率明显高于Ompk35(P<0.05)；且当Ompk35基因缺失时Ompk36也缺失；见图3。

A:M-H平皿中心为美罗培南纸片，1为肺炎克雷伯菌阳性对照，2为阴性对照，3为该院内分离得到的产碳青霉烯肺炎克雷伯菌，4为碳青霉烯酶阴性肺炎克雷伯菌；B:M-H平皿上的两张亚胺培南纸片图1 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶表型试验

图2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌耐药基因PCR电泳图

图3 膜孔蛋白编码基因PCR电泳图

2.3毒力表型试验结果 拉丝试验显示，18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌中阳性2株；生物被膜形成试验显示，高、中、低产生物被膜分别检出6株、5株、7株；血清杀伤敏感性试验显示，抵抗、中介敏感、高敏感分别为5株、5株、8株。

2.4高毒力荚膜血清型及毒力基因检出情况 18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌进行荚膜分型显示，K1型4株，K57型2株，未检出K2、5、20及54，未分型12株。rmpA阳性7株(38.89%)、Acrobactin阳性4株(22.22%)、二者同时阳性7株(38.89%)，rmpA阳性率明显高于Acrobactin(P<0.05)；4株K1型肺炎克雷伯菌均携带rmpA基因，其中1株同时携带Acrobactin基因；2株K57型肺炎克雷伯菌均携带rmpA基因；18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌均携带FimH-1基因。见图4。

图4 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌高毒力荚膜血清型及毒力基因PCR电泳图

2.5毒力表型试验与高毒力荚膜血清型及毒力基因的关系 拉丝试验呈阳性的2株均未检出高毒力荚膜血清型，K1和K57型的6株拉丝试验为阴性。4株K1型中1株血清杀伤作用抵抗，高产生物被膜；3株血清杀伤作用高敏感，低产生物被膜。2株K57型均对血清杀伤作用中间抵抗，中产生生物被膜。

2.6耐药基因与高毒力荚膜血清型及毒力基因的关系 7株携带rmpA基因的耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株均产碳青霉烯酶，其中4株产Kpc、2株产Ndm，1株同时产Kpc和Ndm，均合并膜孔蛋白变异。4株携带Acrobactin基因的菌株中3株产碳青霉烯酶，其中2株产Kpc、1株产Ndm，均合并膜孔蛋白变异。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是医院及社区获得性感染的重要条件致病菌，机体免疫力下降的老年人群常可引发呼吸道、泌尿道感染，甚至导致败血症。碳青霉烯类抗菌药物是目前临床治疗肺炎克雷伯菌的一线药物，但近年来耐药性逐渐增加，耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的治疗预后很差，特别是老年患者。研究发现碳青霉烯类耐药机制可能包括携带多种碳青霉烯酶，分泌超广谱β-内酰胺酶或AmpC酶合并外膜孔蛋白变异，药物作用靶位点改变〔5〕。Kpc基因是我国近年来流行的碳青霉烯酶，Ndm基因自发现起已在全球范围内广泛传播〔6〕。本次研究18株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中均产碳青霉烯，提示碳青霉烯酶是承德市中心医院老年患者中肺炎克雷伯菌耐药的主要因素之一。

肺炎克雷伯菌分泌超广谱β-内酰胺酶或AmpC酶合并膜孔蛋白编码基因变异时，会引发厄他培南耐药，提升亚胺培南的MIC值〔7〕。本次研究中发现超广谱β-内酰胺酶或合并膜孔蛋白变异的菌株出现耐药，还发现Ompk36在肺炎克雷伯菌株对碳青霉烯耐药中发挥重要作用。相关研究发现，K1、K2、K5荚膜型以及rmpA、Acrobactin等毒力相关基因表达水平与肺炎克雷伯菌毒力存在明显关联〔8〕。本次研究中成功分离出4株K1型菌株，分离率较高，且均携带rmpA基因，1株同时携带Acrobactin基因。此外还检出2株菌株，均携带rmpA基因。rmpA基因可调控荚膜合成，Acrobactin基因是肺炎克雷伯菌中主要铁载体细胞，上述两种基因是除荚膜型之外毒力最常见的决定元素。研究者已从耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌株中检出产Kpc基因的高毒力荚膜血清型菌株〔9〕。本次研究从18株菌株中检出产Kpc基因6株，高毒力荚膜型菌株4株；相关研究显示，K1-Hvkp可获得携带Kpc基因的质粒，产生高耐药、高毒力的菌株〔10〕。结合本实验结果可推测高毒力菌株与碳青霉烯类耐药存在关联。

1杨雪妹，吴允孚.碳青霉烯类抗生素对重症监护病房老年患者耐药菌的体外抑菌效果〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(5)：1225-7.

2齐 艳.产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌分子分型及传播机制研究〔D〕.杭州：浙江大学，2012.

3曹在秋.CTX-M型超广谱β-内酰胺酶在肺炎克雷伯菌中的分子进化机制研究〔D〕.郑州：郑州大学，2016.

4李咏梅，高丽娜，张 艳.产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌耐药性分析〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2012；13(3)：291-5.

5苏桂新，王怡杨，王 强.多重耐药HvKP菌株临床感染分布及耐药机制〔J〕.中国老年学杂志，2017；37(12)：3048-50.

6龙翔玲，吴林燕.EICU高血压脑出血并发肺部感染的相关因素和集束化干预效果〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(3)：360-1.

7邓 琼.医院感染血液中肺炎克雷伯菌的分子流行病学及其耐碳青霉烯类抗菌药物危险因素调查〔D〕.南昌：南昌大学，2014.

8刘晓薇，孙 贺，李咏梅.肠球菌临床耐药性分析及耐药基因vanM在屎肠球菌中的检测〔J〕.北华大学学报(自然科学版)，2014；15(4)：482-5.

9李 航，罗俊华，毛向明.泌尿道结石合并感染患者尿液标本中病原菌分布及耐药性分析〔J〕.中国卫生工程学，2017；16(2)：245-6.

10杨继勇.产KPC肺炎克雷伯菌分子流行病学与分子特征研究〔D〕.北京：中国人民解放军医学院，2013.