JARID1B对口腔鳞状细胞癌细胞侵袭、迁移和干细胞样属性的影响

胡广伟 廖天安

(海南省人民医院口腔科，海南 海口 570311)

口腔癌是一种发生在嘴唇和口腔内的恶性肿瘤，传统上习惯将它定义为鳞状细胞癌，因为在牙科学的领域，90%的肿瘤组织学上起源于鳞状细胞〔1〕。鳞状细胞癌有不同程度的分化及淋巴结转移的倾向。JARID1B，也被称作PLU-1，是成视网膜细胞瘤结合蛋白(RBP)2同系物，是jumonji成员，具有H3K4去甲基化酶活性〔2,3〕，在几种恶性肿瘤包括膀胱、前列腺、胸腺癌，肺癌等中过表达〔4～7〕。JARID1B与肿瘤细胞迁移、死亡率增加有关，下调JARID1B 可诱导细胞死亡〔8〕。目前，很少研究报道JARID1B对人口腔癌细胞增殖和迁移的作用。本文主要探讨JARID1B下调后对口腔癌细胞增殖、迁移及干细胞样属性的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 RPMI1640培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)，胎牛血清(FBS)，青-链霉素，购自美国Invitrogen；anti-JARID1B购自英国Abcam公司；Oct4A、CD133、Nanog、FOXO1、HIF1alpha和β-actin购自CST。

1.2病人筛选和细胞来源及培养 80例口腔癌患者，男70例，女10例。年龄30～90岁，研究已通过伦理审查，患者均签署知情同意书。根据AJCC将病人分为4个阶段：第一阶段9例(11.25%)，第二阶段22例(27.50%)，第三阶段13例(16.25%)，第四阶段36例(45.00%)，其中感染部位在颊黏膜36例(45.00%)，舌头21例(26.25%)，齿龈7例(8.75%)，其他部位16例(20.00%)。在手术中，分别钳取距癌灶2 cm的正常黏膜和肿瘤组织，处理后一部分用于病理组织学观察，一部分用于Western印迹实验，还有一部分冻存于-80℃保存待用。

人口腔癌细胞系SAS细胞购自ATCC(American Type Culture Collection,Manassas,VA,USA)。SAS细胞在RPMI1640中培养，RPMI1640培养基中含有10% FBS及青-链霉素(100 IU/ml)，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3方法

1.3.1shRNA腺病毒感染 包含有JARID1B shRNA的腺病毒从和元生物有限公司获得。将SAS细胞接种小皿24 h之后，转染JARID1B shRNA 48 h。JARID1B shRNA靶标序列为5'-TTCCACAGCTTGCTGA-GATG-3'。

1.3.2划痕实验 SAS细胞与shJARID1B处理的SAS细胞(分别为SAS Control组，SAS shJARID1B组)分别接种于六孔板中，孵育48 h。然后用200 μl微量吸液管枪头沿着板中轴在单层细胞划痕。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗掉细胞残渣，新培养基加入六孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。检测划痕间隙距离。

1.3.3人工基底膜细胞侵袭实验 用Transwell检测人工基底膜细胞侵袭。将SAS Control组细胞与SAS shJARID1B组的SAS细胞悬浮于无血清培养基，接种于Transwell小室上层，下层装有10%FBS全培养基。37℃、5%CO2培养箱培养48 h之后，用棉球擦掉上层没有迁移的细胞，迁移到下层的细胞用0.1%结晶紫染色，然后在显微镜下计数。

1.3.4免疫组化实验 临床标本在10%甲醛中固定，并且包埋入石蜡之中；将切片脱蜡和水化。免疫组化染色之前，将脱蜡切片放入37℃烘片2 h，用1%H2O2阻断内源性过氧化物5 min，PBS洗3次，免疫染色封闭液封闭1 h，之后用抗JARID1B抗体(1∶200)孵育4℃过夜。把切片用PBS洗涤，然后用生物素连接的抗血清室温下孵育1 h。再次洗涤切片，用3,3-二氨基联苯胺盐酸盐着色1 min。双蒸水洗涤，苏木素染色1 min，在显微镜下观察。

1.3.5Western印迹实验 用细胞裂解液RIPA(蛋白酶抑制剂∶RIPA为1∶1 000)裂解SAS细胞与shJARID1B处理的SAS细胞，制备细胞裂解产物，离心取上清(组织用匀浆机匀浆之后，离心去上清)，用BCA工作蛋白定量。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白，之后电转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，之后不同一抗孵育过夜，包括抗JARID1B,Slug,Vimentin,KLF4,Oct4A和 β-actin，TBST洗涤，孵育相应的二抗，TBST洗涤，用自动显影仪显影。

1.4统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。采用ImageJ软件及Image Lab软件对条带的灰度值进行定量分析。统计图用GraphPad Prism5软件分析。

2 结 果

2.1JARID1B高表达于口腔鳞状细胞癌组织 JARID1B主要分布于正常口腔上皮细胞口腔鳞状细胞的核，并且JARID1B在口腔鳞状细胞癌组织中的分布显著多于正常组织。Western实验也表明JARID1B显著高表达于口腔鳞状细胞癌组织中(P<0.01)，见图1。

图1 正常口腔黏膜和口腔鳞状细胞癌组织中JARID1B的表达

2.2JARID1B调节SAS细胞侵袭增殖能力 Western印迹实验显示，转染shJARID1B腺病毒可沉默JARID1B在细胞中的表达，见图2。人工基底膜实验表明下调JARID1B显著抑制SAS细胞侵袭能力(P<0.01)，见图3。划痕实验结果表明SAS shJARID1B细胞划痕相对距离显著少于SAS Control细胞，沉默JARID1B可以抑制SAS细胞迁移(P<0.05)，见图4。

2.3JARID1B调节SAS细胞多功能性及致癌性 沉默JARID1B显著抑制Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha表达(P<0.001)。见图5。

图2 Western印迹检测JARID1B的表达

图3 人工基底膜实验检测细胞侵袭能力

图4 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

图5 沉默JARID1B抑制SAS细胞多能性及致癌因子

3 讨 论

口腔鳞状细胞癌具有干细胞特质，容易对药物以及辐射产生抵抗〔9～11〕。因此，针对肿瘤干细胞特异性靶标获得了很大的关注，这也成为强有效的抗肿瘤治疗策略〔12〕。JARID1B属于组蛋白赖氨酸脱甲基酶家族，能够特异性H3K4的靶基因脱甲基〔13〕。

本文中，Western印迹和免疫组化实验表明JARID1B在口腔鳞状细胞癌病人过表达，所以JARID1B可能是口腔鳞状细胞癌重要的预后因素。JARID1B表达与口腔癌细胞生长、运动有关，并且与干细胞标志物蛋白表达呈正比，如Oct4、Nanog、CD133、FOXO1及HIF1alpha。这些表明JARID1B可能是新型的口腔鳞状细胞癌标志物。本研究与之前报道相符，Stewart等〔14〕发现其高表达于急性髓性白血病，敲除JARID1B可中和造血干细胞自我更新的能力，从而说明JARID1B正性调节造血干细胞能力。

本文从蛋白水平证明，在口腔鳞状细胞癌中JARID1B与多能标志物(Oct4、CD113等)有关。证明JARID1B是恶性口腔鳞状细胞癌有潜力的标志物，也证明JARID1B致肿瘤功能是通过促进肿瘤干细胞样活性及而促进细胞侵袭、迁移。

本研究发现补充了对于头颈部肿瘤生物学组蛋白脱甲基的认知，提供了潜在的新型的治疗恶性口腔鳞状细胞癌的靶标。

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