高效液相色谱法同时测定六味补血胶囊中没食子酸、芍药苷和藁本内酯含量

关潇滢 ，曾利娜 ，胡晓谕 ，温晓丽 ，赵 渝 ，肖丽和

(1.广东省深圳市药品检验研究院，广东 深圳 518057； 2.深圳药品质量标准研究重点实验室，广东 深圳518057； 3.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110016)

六味补血胶囊以经典补血养血方剂四物汤为基础，在当归、白芍、熟地黄及川芎4味药材基础上辅以黄芪和紫草，具有益气补血之功效，对女性气血两虚之症具有确切疗效[1]。六味补血胶囊现行质量标准（标准号YBZ05452009）中含量测定项仅选取方中佐药白芍所含的芍药苷进行测定，并未对君药当归及其他药味进行含量控制，存在不足。为完善该制剂的含量测定方法，本研究中选取当归中主要成分藁本内酯[2-4]、白芍中没食子酸[5]和芍药苷[6-7]作为测定指标，并参照藁本内酯[8-9]、没食子酸[10-12]、芍药苷[13-15]3种成分的含量测定方法，建立同时测定上述3种成分含量的高效液相色谱(HPLC)法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

E2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司)，包括2998 PDA检测器、自动进样器、四元梯度泵、Empoer3色谱工作站；XS205型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；TW423L型分析天平（日本岛津公司）；SB-25-12DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药

六味补血胶囊（深圳国源国药有限公司，批号分别为 20151204，20151205，20151206）；没食子酸对照品（批号为 110831-201605，纯度为 90.8%），芍药苷对照品（批号为 110736-201741，纯度为 95.7% ），藁本内酯对照品（批号为111737-201507），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，德国默克公司）；甲醇，磷酸（分析纯，广州化学试剂厂）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Symmetry Shield RP18ODS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈（A） -0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，梯度洗脱条件见表 1；柱温：35℃；流速：1.0 mL ／min；检测波长：没食子酸 280 nm，芍药苷230 nm，藁本内酯334 nm，采用波长切换方式检测；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序表

2.2 溶液制备

取没食子酸对照品80.22 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品贮备液；取芍药苷对照品 101.48 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容至刻度，摇匀，作为芍药苷对照品贮备液；取藁本内酯对照品10.49 mg，精密称定，置20 mL容量瓶中，加甲醇稀释，定容至刻度，摇匀，作为藁本内酯对照品贮备液。均置4℃冰箱备用。精密量取没食子酸对照品贮备液0.5 mL、芍药苷对照品贮备液 0.5 mL、藁本内酯对照品贮备液 0.2 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

称取六味补血胶囊内容物1 g，精密称定，置25 mL容量瓶，加甲醇约20 mL，超声处理30 min，放置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按照六味补血胶囊的处方及制法，制备不含当归和白芍的阴性样品，按供试品溶液制备法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

阴性干扰试验：取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进行测定，记录色谱图。结果没食子酸、芍药苷和藁本内酯峰与其他吸收峰均达到基线分离，阴性无干扰(见图1)。

线性关系考察：精密量取没食子酸对照品贮备液和芍 药 苷 对 照 品 贮 备 液 0.125，0.250，0.500，1.250，2.000，2.500 mL，藁本内酯对照品贮备液 0.04，0.10，0.20，0.30，0.40，1.00 mL，置 10 mL 容量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。按拟订色谱条件测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线。结果见表2。

精密度试验：取同一混合对照品溶液，按拟订色谱条件，连续进样6针，测定峰面积。结果见表2。可见，仪器精密度良好。

重复性试验：取六味补血胶囊（批号为20151206）内容物适量，依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录峰面积。结果见表2。可见，方法重复性良好。

稳定性试验：依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件分别于 0，4，8，12，16，24 h 时测定。结果见表 2。可见，供试品溶液在24 h内稳定。

图1 高效液相色谱图

表2 线性关系考察、精密度及稳定性试验结果（n=6）

加样回收试验：取已知含量的六味补血胶囊（批号为 20151206）内容物 6份，精密称定，各约 0.5 g，分别加入没食子酸对照品贮备液1.0 mL、芍药苷对照品贮备液3.0 mL、藁本内酯对照品贮备液0.5 mL。依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，计算含量及回收率，结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=6）

2.4 样品含量测定

分别精密称取六味补血胶囊(批号分别为20151204，20151205，20151206)内容物1 g，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定，记录峰面积，分别计算含量。结果见表4。

表4 3批样品含量测定结果（mg／g）

3 讨论

3.1 提取溶剂选择

曾考察以相同体积的50%甲醇、70%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇进行超声提取，按拟订色谱条件进行测定，比较没食子酸、芍药苷、藁本内酯的含量。结果表明，甲醇作为提取溶剂时，没食子酸、芍药苷、藁本内酯的含量最高，稳定性最好，峰形对称，分离度好，故选用甲醇作为提取溶剂。

3.2 检测波长选择

分别取没食子酸、芍药苷、藁本内酯对照品贮备液，于200～800 nm波长范围内进行扫描。结果表明，没食子酸约在280 nm波长处，芍药苷约在230 nm波长处，藁本内酯约在334 nm波长处有最大吸收。综合样品中3个成分的出峰时间，设定为 280 nm（0→20 min）、230 nm（20 → 30 min）、334 nm（30 → 44 min），并采用波长切换的方式，实现各个成分在最大吸收波长处同时检测。

3.3 流动相选择

曾以乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%三氟乙酸溶液为流动相，考察分离效果。结果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱时，样品中的各个成分分离效果最好。

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