丹参川芎嗪对兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究

冯登超，高栋梁，白翠翠，高东东 ，武 斌，薛宏斌，杨喜明

（延安大学附属医院烧伤整形手外科，陕西 延安 716000）

增生性瘢痕多发于损伤深度累及真皮的创伤，与正常瘢痕相比，其形成过程中成纤维细胞增殖更活跃，胶原蛋白沉积更明显，导致真皮纤维化更显著[1]。目前，其治疗方法主要有药物、压迫、放射、激光及外科手术等，但均无绝对的权威性[2]。研究证实，早期应用丹芎瘢痕涂膜[3]和维芎瘢痕霜[4]可明显抑制增生性瘢痕的增生。因此，如何调控瘢痕使其增生至适当程度，成为当今医学研究的热点。丹参川芎嗪注射液的主要化学成分为丹参素和川芎嗪，具有抑制炎症[5]、抗纤维化[3]作用。本研究中采用兔耳瘢痕模型，观察了丹参川芎嗪对增生性瘢痕组织的影响，为增生性瘢痕防治药物的临床应用及开发提供理论和实验依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

丹参川芎嗪注射液（贵州拜特制药有限公司，国药准字 H52020959，批号为20150512，规格为每支 5 mL）；鼠抗兔增殖细胞核抗原蛋白(PCNA)单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；三步法染色试剂盒和DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模

取日本大耳白兔 16只，体质量 2.0～2.5 kg，雌雄不论，购自延安大学医学院实验动物中心，分笼饲养。将动物适应性饲养1周后，参照文献[6-7]方法，以30 g／L戊巴比妥钠(30 mg／kg)作耳缘静脉麻醉，兔耳腹侧面皮肤碘伏、乙醇消毒，严格无菌操作技术下，在兔耳腹侧中段沿长轴避开可见血管，作1 cm×1 cm大小创面，创面间隔1 cm以上，去掉兔耳全层皮肤，并用刮勺彻底刮除软骨膜，创缘用电烙铁烧灼，每耳6处，共192个创面，术后创面暴露，待其自行愈合后形成瘢痕增生块。瘢痕组织高度不低于2 mm，硬度与兔耳软骨相似时即为增生性瘢痕[8]。

1.2.2 动物分组及处理

分组：取16只日本大耳白兔，共制备192个全层皮肤缺损创面，伤后21 d创面均出现上皮化，局部注射丹参川芎嗪液。用微量注射器从创面周围的正常皮肤进针向中央内注射，致瘢痕变苍白并稍隆起。注射量每个瘢痕20 μL，每日 1 次，共 5 次。随机分为 4 组(A，B，C，D 组)，各4只兔(48个瘢痕)。实验组(以生药盐酸川芎嗪的质量浓度为基准）中B组给予质量低浓度丹参川芎嗪组(100mg／L)，C 组给予中质量浓度丹参川芎嗪(200mg／L)，D组给予高质量浓度丹参川芎嗪(400 mg／L)；对照组(A组)给予相同容积的生理盐水。

取材方式与处理：于术后第4周，每组随机处死2只白兔，切取标本。按1.2.1项下麻醉方式并消毒，切口沿瘢痕边缘位于兔耳正常皮肤与瘢痕交界处，垂直于皮肤表面，深达软骨表面，整个瘢痕组织完整切取。将每个瘢痕平均分成2份，1份用4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，透明，包埋，切片，然后分别进行HE染色及PCNA免疫组织化学染色;1份用液氮快速冷冻，后转为低温冰箱-80℃保存，氯胺-T法测定羟脯氨酸(HPr)含量。其余继续喂养，术后56 d，同样在麻醉条件下处死每组最后2只白兔，切取瘢痕组织标本。

1.2.3 观察指标与方法

瘢痕厚度测定：术后32，56 d用彩色超声诊断仪(探头超声频率为13 MHz)，同一测定人在相同条件下测定各组创面形成瘢痕的厚度。

瘢痕组织HE染色：瘢痕组织标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续5 mm厚度切片，常规爬片。HE染色，观察增生性瘢痕的病理表现。

PCNA免疫组化：于光镜下观察阳性信号，阳性信号为黄色。在400倍光镜下观察结果，在每张切片的上、中、下、左、右找5个视野进行计数，阳性细胞反应率(R)=阳性细胞数／细胞总数，结果取均数。

HPr含量测定[9-10]：标准管中加入 10 μg ／mL 的L-HPr，空白管调零。计算最终结果：每 1 g组织中HPr含量(mg／g)=测量管光度值÷标准管光度值×10(μg／mL)÷100÷标本质量。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件处理。计量数据以均数±标准差表示，采用配对设计的 t检验、单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 瘢痕组织学观察结果

术后32 d和56 d，实验组瘢痕面积变小，高度变低，质地变软，与对照组比较，差异显著。在HE染色法切片上，对照组瘢痕组织内大量成纤维细胞、细胞外基质和毛细血管可见胶原纤维呈环形或螺旋样排列，组织内少量炎性细胞；实验组瘢痕组织内成纤维细胞明显少于对照组，胶原纤维及成纤维细胞排列较整齐，细胞外基质多，毛细血管减少。在术后56 d，实验组兔耳瘢痕组织较术后32 d真皮层更薄，胶原及成纤维细胞排列更整齐。HE染色结果见图1。

2.2 瘢痕厚度测定

术后32 d和56 d，A组瘢痕组织厚度明显高于B，C，D组，而B组又高于C，D组，C组高于D组。结果见表1。

2.3 PCNA免疫组织化学染色结果

术后32 d和56 d，A组兔耳瘢痕组织PCNA表达明显，黄色为阳性表达，D组PCNA表达明显下降。术后32，56 d，实验组PCNA较对照组标的均有明显下降。详见表1。PCNA免疫组织化学染色结果见图2。

2.4 HPr含量测定

在术后32 d和56 d的瘢痕组织中，HPr含量测定结果表明，实验组较对照组明显下降。结果见表1。

表1 各组兔耳瘢痕增生指数、PCNA阳性表达率和HPr含量比较（±s，mm，n=24）

表1 各组兔耳瘢痕增生指数、PCNA阳性表达率和HPr含量比较（±s，mm，n=24）

注：与 A 组同时点比较，#P ＜0.01；与本组 32 d时比较，bP ＜0.01。

组别 瘢痕增生指数 P C N A阳性表达率 H P r含量(m g／g)A组B组C组D组3 2 d 3.1 2 7 ± 0.2 3 5 2.8 2 9 ± 0.1 9 3#2.4 3 8 ± 0.1 6 5#1.8 5 2 ± 0.1 8 3#5 6 d 3.0 1 5 ± 0.2 2 7 2.6 7 5 ± 0.1 8 5#b 2.3 7 3 ± 0.1 5 4#b 1.7 3 9 ± 0.1 9 2#b 3 2 d 6 8.7 ± 8.3 5 3.2 ± 6.5#4 6.5 ± 5.4#3 2.4 ± 3.9#5 6 d 5 4.9 ± 7.8 4 2.5 ± 5.4#b 3 5.7 ± 4.2#b 2 6.2 ± 3.8#b 3 2 d 1 6.5 8 3 ± 0.2 1 5 1 4.3 2 7 ± 0.1 9 4#1 3.2 5 3 ± 0.1 6 9#1 1.5 8 4 ± 0.1 7 3#5 6 d 1 5.8 6 9 ± 0.2 0 3 1 3.5 1 6 ± 0.1 8 4#b 1 2.7 2 3 ± 0.1 7 9#b 1 0.6 9 4 ± 0.1 8 2#b

图1 术后32 d两组瘢痕组织化学染色结果（HE×400）

图2 术后32 d两组PCNA免疫组织化学染色结果（SP×400）

3 讨论

增生性瘢痕是整形外科基础研究的重要课题之一，严重创伤、烧伤及外科手术后常常遗留增生性瘢痕，影响外观和功能，但一直都缺乏理想的治疗方法。近年研究结果显示，越来越多的学者从中医中药中筛选出疗效确切、不良反应小的药物来抗疤痕纤维化，其中丹参川芎嗪注射液是中药丹参及川芎嗪按科学配方提取的复方注射液。研究证实，川芎嗪为一种新型钙离子拮抗药，可通过直接清除氧自由基、抗脂质过氧化、抑制成纤维细胞分裂和增殖，从而起到抗组织损伤和防治肺纤维化的作用[11]；通过抑制肝脂质过氧化、抑制星状细胞活化增殖、降低胶原合成等途径改善肝功能[12-13]。

本研究中采用局部注射丹参川芎嗪对兔耳瘢痕进行治疗，为避免注射不同浓度或对照药物出现相互影响，造模、随机分组后行局部药物干预，发现实验组中瘢痕组织厚度、硬度与药物浓度呈负相关，实验组瘢痕组织中PCNA蛋白阳性表达率和HPr含量明显减少，呈剂量效应关系；与对照组比较，其表达呈显著性降低；不同时间点(术后32 d和56 d)取材的同浓度实验组间相比，术后56 d的PCNA蛋白阳性表达率和HPr含量较术后32 d明显减少。表明丹参川芎嗪可以明显抑制PCNA蛋白阳性表达率和HPr的生成，进而抑制成纤维细胞的增殖，减少胶原的合成。HE染色结果显示，实验组中成纤维细胞明显少于对照组，表皮层增厚，成纤维细胞排列较规则，细胞外基质多，可见少量毛细血管。说明丹参川芎嗪通过抑制成纤维细胞的增殖，可起到减轻瘢痕形成的作用，其疗效与药物浓度在一定范围内成正比。这与商庆新等[14]的研究结果一致。丹参川芎嗪为中药丹参素和川芎嗪的衍生合成制剂，其药理作用强，不良反应小。进一步研究其药理活性，可望开发出高效、低毒、价廉的抗瘢痕新药，有望通过改变药物的剂型，增加药物皮肤的渗透性，从而成为预防和治疗人皮肤增生性瘢痕的有效药物。

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