辽藁本药材与饮片指纹图谱对比研究

瞿昊宇，谢梦洲，陈光宇*，何 群

(1.湖南省药食同源功能性食品工程技术研究中心，湖南 长沙 410208；2.中医诊断学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3.中医心肺病证辨证与药膳食疗重点研究室，湖南 长沙 410208；4.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

藁本为伞形科植物藁本LigusticumsinenseOliv.或辽藁本LigusticumjeholenseN akai et Kitag.的干燥根茎及根，有散风寒湿邪之功效，主治风寒头痛、巅顶痛、寒湿腹痛、泄泻、症瘕、疥癣等，性味辛、温，入膀胱经[1-2]，用药历史悠久，以饮片入药。阿魏酸是藁本中的主要活性成分，而且在20个产地中均含有，可以作为评价藁本药材质量的活性成分[3-4]。研究表明阿魏酸具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羟色胺释放、抑制血小板血栓素A2(TXA2)的生成和增强前列腺素活性等作用，同时还有报道表明阿魏酸具有镇痛和缓解血管痉挛等作用[5-6]，它同时在人体中可起到健美和保护皮肤的作用[7]。辽藁本质量属性(阿魏酸含量、挥发油含量、浸出物含量等)优于藁本[8-9]。(2020年版《中国药典》一部)对藁本药材及饮片项下规定了性状、鉴别、检查、浸出物、含量测定等，未规定指纹图谱检测[10-11]。但仅从已有的检测项目无法全面控制藁本药材及饮片的质量，研究其单体成分并不能洞悉藁本功效的全貌，不能全面反映藁本炮制前后质量属性的改变，从而影响藁本药材及饮片的质量控制及质量评价。故为比较辽藁本炮制前后化学成分的变化及质量传递信息，评价辽藁本药材及饮片的质量属性，本文通过研究辽藁本炮制前后指纹图谱的改变，为辽藁本药材及饮片质量控制及质量标准的建立提供依据，为确保辽藁本饮片的质量与疗效，考察与评价从辽藁本药材-饮片质量属性变化提供依据。目前，国内外已有相关文献报道藁本药材或饮片的指纹图谱研究，但其方法未被法典收载，对于量质传递研究还欠依据。本研究基于液相色谱法，对文献报道的藁本指纹图谱研究进行验证，根据指纹图谱验证试验结果，对藁本指纹图谱峰进行辨认，为藁本药材-饮片量值传递提供依据。

1 仪器与药材

1.1 仪器

Ultimate 3000高效液相色谱系统(赛默飞世尔科技(中国)有限公司；包括G1316A四元梯度泵，G1313A标准型自动进样器，G1316A恒温箱，G1314A紫外检测器，Agilent Chemstation 色谱工作站)；中文液晶台式超声波清洗器(昆山美美超声仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；TCS-100型电子台秤(上海乾峰电子仪器有限公司)；PW135型中草药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)；SHH.W21电子三用水箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；QY-1中药切片机(温州顶历医疗器械有限公司)；101-0AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)。

1.2 药材及试剂

辽藁本各批原药材经王智老师鉴定为伞形科植物辽藁本LigusticumjeholenseNakai et Kitag.的干燥根茎和根；辽藁本各批饮片，由本实验室通过优化炮制工艺参数，按最佳炮制工艺制备饮片；阿魏酸对照品(批号：110773-201614)，规格：50 mg，纯度：不少于99.0%，购自中国食品药品检定研究院(国家药品标准物质)，供含量测定用；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水；液相色谱柱(月旭，Ultimate© XB-C18，4.6 mm×250 mm，5μm)。

2 方法与结果

2.1 辽藁本饮片的制备

首先将辽藁本药材除杂质泥沙，除去蒂头须根，剔除异物，淋洗22 min，沥干，切3～4 mm厚片，铺层(堆放)2 cm厚，50～60 ℃鼓风干燥，翻动1次。

2.2 辽藁本指纹图谱测定方法

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验[5-6]液相色谱柱(以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，月旭公司Ultimate XB-C18型，5μm，4.6×250 mm)，以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)为流动相；梯度洗脱(0～15 min，10%→20%A；15～60 min，20%→85%A；60～65 min，85%→10%A；65～70 min，10%A)；流速：1.9 mL·min-1，检测波长为304 nm，柱温：30 ℃，进样量：10μL，理论板数按阿魏酸峰计算应不低于2 500。

2.2.2 阿魏酸对照品溶液的制备 取阿魏酸约10 mg，精密称定，置于10 mL棕色容量瓶中，精密加入70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含阿魏酸1.13 mg的阿魏酸对照品浓溶液1，精密移取1 mL阿魏酸对照品浓溶液1置10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含阿魏酸0.113 mg的对照品浓溶液2，精密移取2 mL阿魏酸对照品浓溶液2于10 mL棕色容量瓶中，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含阿魏酸22.6μg的对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜至进样小瓶中，即得。

2.2.3 供试品溶液制备的基本方法 取各批辽藁本药材及饮片粉末(过三号筛)约1.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50.0 mL，密塞，称定重量，置超声波提取器中超声60 min(250 W，50 Hz)，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取10 mL上清液离心7 min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜至进样小瓶中，即得供试品溶液。

2.2.4 阴性对照供试品溶液的制备 取缺辽藁本药材样品的流动相溶剂(甲醇)，按“2.2.3”同法制备，即得阴性供试品溶液。

2.3 辽藁本指纹图谱分析方法验证

2.3.1 精密度试验 取同一供试品溶液，连续进样6次，检测指纹图谱峰，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，阿魏酸色谱峰面积RSD=1.638%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验 取同一批样品6份，按供试品溶液的制备法制备成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别进样，测定其色谱图，各共有峰相对保留时间和峰面积的比值大体一致，阿魏酸色谱峰面积RSD=2.437%(n=6)，表明本分析方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、48、72 h进样，测定其HPLC谱图，各共有峰相+对保留时间和峰面积的比值基本一致，阿魏酸色谱峰面积RSD=2.826%(n=6)，表明本分析方法的稳定性良好，供试液在48 h内稳定。

2.4 辽藁本药材及饮片指纹图谱的建立

将GB-01、02、03、04、05、06、07、08、09、10、11、12、13、14、15共15批辽藁本药材及饮片色谱图的cdf格式文件导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件中，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本”软件进行分析，设定辽藁本药材GB-01及饮片GB-01色谱图为参照图谱，时间窗宽度为0.1 min，进行全谱峰匹配，结果见图1，图2，生成辽藁本药材对照特征图谱(43个共有峰，筛选后有6个共有峰，见图3)及辽藁本饮片对照特征图谱(原有38个共有峰，筛选后有6个共有峰，见图4)。阴性对照品溶液(甲醇空白)见图5，阿魏酸对照品溶液见图6，辽藁本药材供试液指纹图谱见图7，辽藁本饮片供试液指纹图谱见图8，各批药材供试品对照特征图谱相似度见表1。各批饮片供试品对照特征图谱相似度见表2。

表1 15批辽藁本药材HPLC指纹图谱相似度

表2 15批辽藁本饮片HPLC指纹图谱相似度

图1 15批辽藁本药材指纹图谱

图2 15批辽藁本饮片指纹图谱

图3 辽藁本药材对照特征图谱

图4 辽藁本饮片对照特征图谱

图5 阴性对照品指纹图谱

图6 阿魏酸对照品指纹图谱

图7 辽藁本药材GB-01指纹图谱

图8 辽藁本饮片GB-01指纹图谱

根据15批辽藁本药材指纹图谱匹配结果，可匹配成功43个共有峰，经过筛选可得6个共有峰。经过与对照品对比标定出1个色谱峰，为2号(阿魏酸)。

根据15批辽藁本饮片指纹图谱匹配结果，可匹配成功38个共有峰，经过筛选可得6个共有峰。经过与对照品对比标定出1个色谱峰，为2号(阿魏酸)。

辽藁本药材各指纹图谱相似度值皆大于0.9，故可以辽藁本药材指纹图谱相似度不低于0.9作为辽藁本药材指纹图谱质量标准。

辽藁本饮片各指纹图谱相似度值皆大于0.9，故可以辽藁本饮片指纹图谱相似度不低于0.9作为辽藁本饮片指纹图谱质量标准。

对15批辽藁本药材和饮片指纹图谱相似度进行配对t检验，得均值差异检验t=0.239 4，df=14，P=0.814 3，结果表明辽藁本药材和饮片指纹图谱大体一致，辽藁本炮制前后其化学成分变化的差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

藁本有藁本和辽藁本两个基原，前期研究表明辽藁本质量优于藁本，藁本药材大多不符合《中国药典》(2015版一部380页)藁本项下有关规定，故本实验选用辽藁本研究其炮制前后的指纹图谱。

本文采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》 规定的相似度计算法对15批辽藁本药材及饮片的指纹图谱进行分析结果较好。

辽藁本含挥发油、阿魏酸等对热不稳定的有效成分，尽管优化了炮制工艺参数，但炮制过程中仍然有少部分损失，15批辽藁本药材指纹图谱可匹配成功43个共有峰，15批辽藁本饮片指纹图谱匹配结果，可匹配成功38个共有峰，比药材少了5个峰，说明含量低的成分在炮制过程中损失了，但整体来说，辽藁本炮制前后其化学成分变化的差异无统计学意义(P>0.05)。