外泌体传输microRNA 在心血管疾病中的研究进展

纪细心，刘剑，张文超，陈硕，周锐飞，董一飞

(南昌大学第二附属医院，南昌330006))

心血管疾病是我国高发病率、高病死率、高致残性疾病，推算现患人数2.9亿，病死率占首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上[1]。因此研究心血管发病机制，为临床治疗提供良好的治疗方案非常重要，传统机制包括肾素-血管紧张素系统、炎症氧化应激等。近年来随着医学的发展和进步，发现细胞外囊泡，尤其外泌体(曾认为是细胞丢弃的垃圾)参与多系统信息交流和信号转导，产生生物学效应。microRNA具有调控基因表达、参与表观遗传修饰、细胞增殖及细胞凋亡等多种生命活动的功能，在心血管疾病发生发展过程中起重要作用。现就近年来外泌体传输microRNA在心血管疾病中的研究进展作一综述，为临床心血管疾病发病机制及治疗提供方向和指导。

1 外泌体基本生物学特征

1.1 外泌体来源及其内容物 20世纪80年代，研究发现红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以传递转铁蛋白，并首次将这种囊泡亚型命名为exosome(外泌体)。 随后发现多种细胞(肿瘤细胞，T细胞，B细胞，树突状细胞，内皮细胞等)可以分泌外泌体，广泛存在于血液、尿液、胆汁、唾液等生物体液，随循环在体内流动，通过不同方式产生生物学效应。目前，发现外泌体含有9 769种蛋白质，3 408种mRNA，2 838种microRNA及1 116种脂类。外泌体公认的标志蛋白主要有跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、ESCRT-相关蛋白(Alix、Tsg101)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp90)、囊泡分选相关蛋白(Rab GTPases蛋白、annexins 、 flotillin)等[2]，这些成分多与外泌体的形成与起源有关。

1.2 外泌体形成机制 外泌体是由细胞内吞衍生所形成的直径在40～100 nm的微膜囊泡。目前比较认可的机制为：早期的外泌体随着细胞膜内出芽过程的开始而形成，也称早期核内体，早期核内体再次内出芽形成各种管腔内囊泡，形成晚期核内体，包含腔内囊泡的晚期核内体称为多囊泡体，多囊泡体被运输到溶酶体进行降解，或多囊泡体与细胞质膜融合从而将其内容物释放到胞外环境中，所释放的腔内囊泡为外泌体[3]。有研究表明外泌体的释放主要由Rab家族蛋白调节，其中Rab27a 和Rab27b 控制不同阶段外泌体分泌途径[4]；其次，Rab35和Rab11也能调节其分泌。关于调节外泌体分泌机制学说主要为ESCRT依赖机制、四跨膜蛋白依赖机制、脂质依赖机制。

1.3 外泌体发挥效应学机制 外泌体广泛存在于体液中，是机体自身细胞产生，无免疫原性，无疑可以看成是“内分泌”亚学科，通过自分泌、旁分泌、远分泌方式发挥生物学效应，与靶细胞作用方式如下：配体(即外泌体)与靶细胞膜蛋白受体相结合方式信号转导；外泌体与靶细胞膜融合，释放其内容物到靶细胞内发生效应作用；外泌体被内吞影响靶细胞功能[5]。上述机制可能单一发生或者混合发生，在细胞不同应激状态，其机制可能会发生变化，这仍需进一步研究证实，从而便于深入干预其中某个机制环节更好的为临床服务。

2 外泌体传输microRNA在心血管疾病中的作用

来源于母体细胞的外泌体携有蛋白质、mRNA、microRNA等生物活性物质，不仅反映其细胞来源，而且体现细胞生理病理状态。此外，绝大多数血浆的microRNA包裹在外泌体或RNA-蛋白复合物，这使外泌体microRNA很可能成为心血管疾病诊断标志物。当心肌受损时，心肌细胞就会释放特异性microRNA入血液循环中。Kuwabara等研究29个急性冠脉综合症患者和24个健康人的血浆microRNA变化，比较这两组人群血浆心肌特异性microRNA-1、microRNA-133a水平，结果发现急性冠脉综合症患者血浆microRNA-1、microRNA-133a水平明显升高，而且microRNA-133a以外泌体方式释放到血液中[6]。此外，有研究表明血浆microRNA比肌钙蛋白(TnT、TnI)更早更快释放入血，microRNA很可能以外泌体运输，microRNA更有判断预后意义的价值。Matsumoto等[7]研究发现外泌体传输microRNA能预测急性心肌梗死后发生缺血性心力衰竭的风险。他们检测急性心肌梗死后发生心力衰竭患者血浆中377种microRNA，发现p53调控的microRNA-192、microRNA-194、microRNA-34水平明显升高，且富集在外泌体，这三种microRNA与患者急性心肌梗死1年后发生心力衰竭的风险密切相关，因此这便于指导临床上医护人员早期干预，延缓疾病进展，改善患者生活质量。

2.1 动脉粥样硬化 内皮细胞功能障碍、平滑肌细胞迁移及增生、炎细胞浸入等是动脉粥样硬化发生的重要因素。研究表明外泌体是参与上述细胞交流的重要介质。kruppel样转录因子2(KLF2)有抗炎，稳定血管内皮，防止血栓形成等作用，在抗动脉粥样硬化性疾病中具有重要的调节作用。Hergenreider等[8]研究表明过表达KLF2内皮细胞来源的外泌体，可以减轻ApoE-/-小鼠的血管动脉粥样硬化。在体外实验进一步证实这效应来源于内皮细胞主动分泌的外泌体携带的microRNA-143/145(为KLF2的下游靶点)，从而导致平滑肌细胞表型改变。此外，平滑肌细胞分泌的外泌体可通过旁分泌方式调节内皮细胞的功能。人主动脉平滑肌细胞(HAoSMCs)与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共孵育，结果发现HUVECs自噬被抑制，进一步证实HAoSMCs分泌携带microRNA-221/222的外泌体，通过PTEN/Akt通路抑制HUVECs自噬调节血管功能[9]。另一项研究表明，过表达KLF5血管平滑肌细胞通过分泌含有microRNA-155外泌体，传送给内皮细胞，损害内皮细胞紧密连接，抑制内皮细胞增殖、迁移，破坏内皮屏障的完整性，导致内皮渗透性增加，最终促进动脉粥样硬化的发展[10]。此外，巨噬细胞来源泡沫细胞分泌的细胞外囊泡(包括外泌体)，通过整合素及下游的ERK/AKT机制调节细胞骨架肌动蛋白和黏着斑，促进血管平滑肌细胞的迁移和黏附[11]。以上研究表明外泌体介导细胞间的交流在动脉粥样硬化发展中发挥着重要的作用。

2.2 高血压、肺动脉高压 肾素-血管紧张素系统在高血压病理中发挥着重要的作用。有研究表明在心脏压力负荷情况下，心肌细胞分泌携带AT1R的外泌体入血，调节血流动力学中的血压变化。在AT1R基因敲除小鼠中，外源性输入携带AT1R的外泌体，结果发现携带AT1R的外泌体被骨骼肌细胞、心肌细胞及肠系膜阻力血管摄取，恢复了AngⅡ诱导的血压变化[12]。因此，在压力负荷下心肌细胞分泌的携带AT1R的外泌体，在血压调节中发挥着重要的作用。Gildea等[13]研究表明尿液来源的外泌体携带47种microRNA可能与个体血压对盐敏感性有很大的关联性。这两项研究表明外泌体在高血压病理中发挥着不可忽视的作用。肺动脉高压是一种发病率高、危害性强、病死率高的疾病，因而研究其病理生理对指导临床治疗发挥着不可忽视的作用。有研究表明在肺动脉高压中，肺动脉内皮细胞(PAEC)与肺动脉平滑肌细胞(PASMC)通过外泌体进行信息交流促进疾病的发展。PASMC分泌携带microRNA-143-3p的外泌体促进PACE炎症和血管生成效应，干扰外泌体携带的microRNA-143-3p阻断了肺动脉高压的发生[14]。与之相反，间充质干细胞来源的外泌体逆转了野百合碱诱发肺动脉高压的发生发展，结果进一步证实是由于外泌体携带不同microRNA介导不同的效应，间充质干细胞来源的泌体携有高水平的microRNA-34a、-122、-124、-127，这4种microRNA具有抗炎、抗增殖效应[15]。综上所述研究表明携带不同microRNA的外泌体在肺动脉高压中发挥着不同的作用，为肺动脉高压治疗提供新的方向和靶向治疗。

2.3 心肌梗死、缺血再灌注损伤 心肌梗死是心血管疾病患者病死的主要病因，近年来研究表明外泌体是心肌梗死的重要介质。Gallet等[16]表明心肌球细胞来源的外泌体通过心肌内注射，减少猪的急性心肌梗死面积，改善射血分数，同时改善了慢性病理性重塑(减少疤痕面积、改善纤维化、增加血管密度)。目前急性心肌梗死治疗措施主要是血运重建，其虽在一定程度上减少患者的病死率和改善预后，但缺血再灌住损伤大大减弱其疗效。Vicencio等[17]研究表明血液来源的外泌体改善了心肌缺血再灌注损伤，该机制是通过外泌体膜的HSP70结合在心肌细胞膜上TLR4，进而激活ERK/p38MAPK/HAP27发挥心脏保护作用。此外，Liu等[18]研究表明在体外实验中，间充质干细胞来源的外泌体减少H2O2诱导H9C2心肌细胞的ROS产生，通过AMPK/mTOR和Akt/mTOR信号通路增加自噬水平，最终抑制细胞凋亡。而且注射间充质干细胞来源的外泌体减少缺血再灌住损伤诱导的心肌细胞凋亡和梗死面积，上调自噬相关蛋白，改善心脏功能。以上研究为我们理解心肌梗死和缺血再灌注损伤提供新的机制，为寻求更好的治疗方案提供新的指导方向。

2.4 心力衰竭 心力衰竭是心脏泵功能障碍导致能量供不应求，引起体循环和(或)肺循坏淤血的综合征。有研究表明microRNA或携带microRNA的外泌体与心衰疾病预后相关，外泌体携带microRNA能预测急性心肌梗死后发生心力衰竭的风险[7]。此外，有研究显示外泌体参与心脏细胞间的信息交流。Bang等[19]研究表明心脏成纤维细胞来源的外泌体携带micro-21*(microRNA-21主要存在于成纤维细胞中，micro-21*存在于成纤维细胞分泌的外泌体中)，被心肌细胞摄取，靶向调节SORBS2和PDLIM5促进心肌细胞肥大，在体内实验中通过注射micro-21*抑制剂逆转了微泵注射AngⅡ诱导心脏肥大效应。这进一步表明外泌体以旁分泌方式在心脏细胞间信号转导中发挥着重要的作用。

2.5 其他 除上述外，有研究显示外泌体在糖尿病心肌病中发挥着不可忽视的作用。Wang等[20]研究显示，成年2型糖尿病大鼠的心肌细胞与内皮细胞共孵育，结果发现抑制内皮细胞的增殖、迁移及血管形成，这一效应来源于病理状态下的心肌细胞分泌高水平micro-320外泌体，被内皮细胞摄取并靶向调节其下游基因IGF-1、HSP20及Ets2影响内皮细胞功能，这效应可被外泌体形成或释放的抑制剂GW4869取消。而且，过表达micro-320抑制心脏内皮细胞的迁移及血管形成，敲除micro-320的作用与之相反。这为糖尿病心肌病血管异常治疗提供新的方向。另有研究提示脓毒症中心肌损伤被间充质干细胞“营救”，这主要来源于间充质干细胞分泌携带micro-223的外泌体，靶向调节心肌细胞Sema3A和Stat3，抑制炎症反应和心肌细胞凋亡，发挥保护心脏的作用[21]。提示携带micro-223的外泌体可能是脓毒性心肌病的心脏保护剂，但这仍需大规模试验来验证。

3 干细胞分泌的外泌体治疗前景

干细胞移植减少埂塞面积、改善左室射血分数、增加血管密度和维持心脏功能成为心脏再生学中的热点。在动物模型上用干细胞移植改善急性心肌梗死后的心脏功能，结果发现移植到梗死附近的干细胞大多没有转化为心肌组织(比如心肌细胞)，且移植2周后存在的干细胞少于6%[22]。这提示其他机制参与心脏修复过程。最近越来越多的研究者认为是干细胞旁分泌的活性物质发挥生物学效应。最新研究显示干细胞分泌的物质减轻心脏损伤主要是外泌体，外泌体携带的蛋白质、microRNA等活性物质可以修复细胞损伤。Feng等[23]研究表明用缺血预处理的间充质干细胞治疗急性心肌梗死，减少心肌细胞凋亡和心脏纤维化，这效应来源其分泌携带microRNA-22的外泌体被心肌细胞摄取并靶向调节下游的甲基-CpG结合蛋白2发挥心脏保护作用。此外，还有Ibrahim等[24]研究表明人源性心肌球细胞分泌的外泌体减少心肌细胞凋亡、促进心肌细胞增殖和血管形成，而且在体内动物实验中，注射人源性心肌球细胞来源的外泌体复制出其母细胞对心脏保护的作用，进一步证实这效应可能来源于外泌体富含micro-146发挥的作用。Khan等[25]研究表明在急性心肌梗死模型中，胚胎干细胞来源的外泌体促进新生血管形成、增强心肌细胞存活，而且促进心脏祖细胞的存活和增殖，进一步证实是外泌体携带的micro-294促进心脏祖细胞存活和增殖。以上研究表明外泌体在心脏治疗中，不仅无免疫原性和致畸胎性，并显示很好的安全性，复制出干细胞修复心脏的效益，这无疑促进干细胞源的携带micro-RNA外泌体在心血管疾病治疗中的快速发展。当然，外泌体临床治疗仍需不断努力探索中。

综上所述，外泌体传输microRNA广泛参与心血管疾病，干细胞来源的外泌体在心血管疾病治疗中体现更大的优越性。虽然外泌体研究仍存在很多不明确问题，如外泌体半衰期、治疗方式影响、外泌体疗程等。但对外泌体在心血管疾病方面的研究目前正处于初级阶段，随着生物科学技术发展，相信将来外泌体在心血管方面的研究将取得较好的治疗前景。

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