ACS合并T2DM患者外周血淋巴细胞中PPAR-γ、MMP-9、eNOS的表达变化及其与冠脉病变程度的相关性

段淑香,徐庆国,周国,张洪强,孟海燕

(1山东省立第三医院，济南250031；2济南军区总医院)

急性冠脉综合征(ACS)患者病死率高、预后差，是心血管疾病的重中之重，2型糖尿病(T2DM)的患者中ACS的发病率是非糖尿病患者的2～3倍[1,2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)是一类核转录因子，由配体或激活物激活，有研究证明PPAR-γ在冠状动脉粥样硬化斑块(AS)中高表达。PPAR-γ与T2DM密切相关，通过多种途径改善糖脂代谢[3]。PPAR-γ通过激活内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，产生NO，降低氧化应激，增强NO的生物利用度，抑制黏附级联和血管炎症，可有效防止ACS的发生、发展。基质金属蛋白酶9(MMP-9)，是一种以锌离子为辅助因子，降解细胞外基质的蛋白酶，通过崩解纤维帽成分参与AS纤维帽破裂的过程，已经证实在AS破裂处高度表达[4]。本课题旨在观察ACS合并T2DM的患者与单纯ACS患者外周血淋巴细胞中PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白和mRNA表达水平的不同，分析其与冠脉病变程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年1～10月于山东省立第三医院确诊为ACS并经冠状动脉造影术明确冠状动脉粥样硬化病变的患者82例，男67例、女45例，年龄(62.59±8.4)岁，其中合并T2DM患者42例(ACSDM组)，男26例、女16例，年龄(63.91±8.7)岁；不合并T2DM患者40例(ACS组)，男25例、女15例，年龄(61.72±8.3)岁。入选标准：ACS和T2DM的诊断标准参见文献[5,6]。排除标准：心功能不全经评定为NYHA Ⅲ～Ⅳ级的患者；左室射血分数<40%；有严重的肝、肾、肺功能损害；心肌炎、心肌病、感染性心内膜炎等心脏疾病；妊娠；低血压、高血压危象、酮症酸中毒、高血糖高渗状态；恶性肿瘤；严重感染、免疫性疾病、近期服用TZDs、贝特类等药物；依从性差的患者。另选取同期健康体检者30例(对照组)，男16例、女14例，年龄(62.15±8.1)岁。三组入试者性别、年龄差异无统计学意义(P均>0.05)。所有入试者均已签署知情同意书。

1.2 外周血淋巴细胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS mRNA表达检测 采用RT-PCR法。所有入选者在胸痛发作24 h内(对照组于入院后)抽取静脉血3 mL，分离外周血淋巴细胞，提取外周血淋巴细胞总RNA，严格按照操作说明进行，RNA的逆转录反应；利用PPAR-γ、MMP-9、eNOS特异性引物序列扩增合成cDNA，在PCR仪上进行定量检测，结合扩增曲线及溶解曲线分析，将符合要求的样本基因定量PCR原始数据取3次重复的平均值，经β-actin校正，用Light Cycler自带分析软件进行数据处理，用2-ΔΔCt法分析数据。

1.3 外周血淋巴细胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白表达检测 采用Western blotting法。首先使用裂解液提取淋巴细胞总蛋白，配制浓缩胶和分离胶，上样量30 μg，浓缩胶为80 V，分离胶120 V进行电泳，电泳结束后，取出凝胶，进行转膜， 200 mA恒流转膜约1～2 h，电压在80～95 V；5%脱脂奶粉封闭非特异性蛋白，37 ℃摇床中振动约2 h；分别加入抗β-actin(稀释度1∶1 000)、抗PPAR-γ(稀释度1∶1 000)、抗MMP-9(稀释度1∶1 000)、抗eNOS(稀释度1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜约18 h；TBST漂洗15 min×3次；加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔或抗小鼠IgG二抗(1∶10 000用封闭液配制)，37 ℃摇床中摇动约1 h；TBST漂洗后 ECL发光液进行发光，凝胶扫描成像系统进行扫描，显示条带，软件分析灰度值，进行比较。

1.4 冠状动脉造影术后冠脉病变程度评估 入院后第7天，行冠状动脉造影术，采集6个不同体位图像，定性分析病变特点。Gensini系统评分方法评估冠脉病变狭窄水平： 1%～25%狭窄记1分；26%～50%记2分；51%～75%记4分；76%～90%记8分；91%～99%记16分；100%(全闭)记32分；LM病变记5分；LAD或LCX近段记2.5分；LAD中段记2.5分；LAD远段、LCX中远段、RCA记1分；小分支病变记0.5分。每处病变狭窄程度分值乘以病变部位分值为一处病变的积分值，每位患者最后Gensini积分为所有病变积分总和。

2 结果

2.1 三组外周血淋巴细胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS蛋白表达比较 ACS组、ACSDM组外周血淋巴细胞PPAR-γ 、eNOS蛋白表达均低于对照组(P均<0.05)，ACSDM组PPAR-γ、eNOS蛋白表达均低于ACS组(P均<0.05)，ACS组、ACSDM组MMP-9蛋白表达均高于对照组(P均<0.05)，ACSDM组MMP-9蛋白表达高于ACS组(P<0.05)。见表1。

表1 三组PPAR-γ、eNOS、MMP-9蛋白表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与ACS组比较，bP<0.05。

2.2 三组外周血淋巴细胞PPAR-γ、MMP-9、eNOS mRNA表达比较 ACS组、ACSDM组外周血淋巴细胞PPAR-γ 、eNOS mRNA表达均低于对照组(P均<0.05)，ACSDM组PPAR-γ、eNOS mRNA表达均低于ACS组(P均<0.05)，ACS组、ACSDM组MMP-9 mRNA表达均高于对照组(P均<0.05)，ACSDM组MMP-9 mRNA表达高于ACS组(P<0.05)。见表2。

表2 三组外周血淋巴细胞PPAR-γ、eNOS、MMP-9 mRNA表达比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与ACS组比较，bP<0.05。

2.3 ACS组及ACSDM组Gensini积分比较 ACSDM组Gensini积分高于ACS组(42.49±5.02 vs 27.93±7.11，P<0.05)。

2.4 PPAR-γ、eNOS、MMP-9蛋白表达水平与Gensini积分的相关性 Gensini积分与PPAR-γ、eNOS蛋白表达均呈负相关(r分别为-0.803、-0.873，P均<0.05)，与MMP-9蛋白表达呈正相关(r=0.965，P<0.05)；PPAR-γ蛋白表达与eNOS蛋白表达呈正相关(r=0.95，P<0.05)，PPAR-γ蛋白表达及eNOS蛋白表达与MMP-9蛋白表达均呈负相关(r分别为-0.816、-0.865，P均<0.05)。

3 讨论

ACS包括急性心肌梗死、不稳定型心绞痛和心源性猝死，它们均有共同的病理生理机制，即AS破裂，继而出血和血栓形成，引起冠状动脉完全或不完全闭塞导致的一系列临床症候群[7]。糖尿病是心血管疾病主要的危险因素之一。糖尿病患者动脉硬化及其动脉并发症进行性增加，50%以上的糖尿病患者死亡的主要原因是动脉并发症[8]。内皮功能障碍是糖尿病主要的病理生理改变，是引发血管并发症的基础。有研究发现，在高血糖状况下，大约7 d左右心脏瓣膜即可出现动脉粥样硬化改变[9]。 国内学者分析了1 419名冠状动脉造影患者的血管狭窄程度，在比较了冠状动脉病变血管数量、完全闭塞血管比例和Gensini评分后，发现冠脉血管病变严重程度随着空腹血糖水平增加而增加[10]。

PPAR-γ是核转录因子超家族成员之一，除了在脂肪组织中表达丰富外，在血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞和心肌细胞中均有表达。PPARs作为转录调节激活物，是调节糖、脂质代谢的重要因子，参与机体的炎症反应、脂质代谢、细胞凋亡、基质的重构、平滑肌迁移、分化和AS等病理过程。研究者认为PPAR-γ是心血管疾病的预警指标，是负性调节因子，具有抗炎和抗AS的作用。PPAR-γ能通过多种途径抑制炎症介质的表达，延缓AS形成的进展。PPAR-γ有两种配体，分为天然配体和人工合成配体。天然配体包括花生四烯酸系列产物如15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)，多不饱和脂肪酸，二十六碳六烯酸等，其中15d-PGJ2是目前使用最广泛的PPAR-γ配体。

研究显示，PPAR-γ激动剂具有促进eNOS 产生更多的内皮源性NO(EDNO)，提高内皮祖细胞迁移活性的作用。有研究表明，EDNO不仅可以诱导内皮细胞的增殖、迁移，还参与干细胞或祖细胞的动员、招募作用，因此可介导血管生长因子的血管新生作用，但外源性 NO 可能不具有此作用。近来有学者提出，PPARs是通过内皮细胞的NO和磷脂肌醇信号途径来抑制内皮素的产生。利用脑微血管内皮细胞实验证明，PPARs可以激活磷脂肌醇信号途径来提高NO水平。本实验研究证实，ACS组和ACSDM组PPAR-γ、eNOS蛋白和mRNA表达均低于对照组，其中ACSDM组降低更甚，冠脉病变程度与PPAR-γ、eNOS表达呈负相关，PPAR-γ表达与eNOS表达呈正相关。说明PPAR-γ、eNOS 在保护内皮细胞功能中发挥重要作用，PPAR-γ可能通过上调eNOS的表达发挥内皮保护作用。

PPAR-γ可通过调节核因子-κB、激活蛋白-1、信号转导与转录激活子信号转导通路抑制炎症因子如MMP-9等表达，抑制炎症反应，从而预防和减缓AS的发生和发展。PPAR-γ可通过抑制MMP-9的表达，抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，影响斑块稳定性。PPAR-γ配体可通过抑制MMP-9的表达，抑制单核细胞的游走现象。Nikolaus等研究发现配体激活的PPAR-γ能够通过抑制血小板源性生长因子诱导的血管平滑肌细胞MMP-9表达和降低明胶酶的分解活性，抑制平滑肌细胞迁移，延缓动脉粥样硬化进程。本实验结果显示，冠脉病变程度与与MMP-9表达呈正相关，PPAR-γ与MMP-9表达呈负相关，PPAR-γ在ACS合并T2DM患者中表达明显下降，而MMP-9在ACS合并T2DM患者中表达高于对照组和ACS组，提示糖尿病患者出现易损斑块并发生急性冠脉综合征与MMP-9水平升高有关，而MMP-9已经证实是斑块不稳定因素之一，则PPAR-γ可通过抑制MMP-9的表达，影响斑块稳定性，防止ACS等恶性心血管事件的发生，降低心血管疾病的病死率。

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