卵巢癌细胞株SKOV3在人脐带间充质干细胞培养液中的增殖、凋亡和迁移情况观察

袁晓凤，袁修凯，周芳

(1中国人民解放军第97医院，江苏徐州 221000；2睢宁中医院)

脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞[1,2]。hUC-MSCs取材方便，易于分离培养，低免疫原性低，且遗传性状稳定[3,4]，故被认为是组织工程的理想种子细胞。越来越多的研究发现，间充质干细胞(MSCs)和肿瘤之间具有密切的联系[5,6]，卵巢癌是妇产科最常见的恶性肿瘤之一，由于该肿瘤起病比较隐匿，缺乏特异表现，在临床上确诊时大多已经晚期，是女性生殖系统肿瘤中病死率最高的肿瘤。本研究以卵巢癌细胞株SKOV3为研究对象，观察了卵巢癌细胞株SKOV3在hUC-MSCs培养液hUC-MSCs培养液中的增殖、凋亡和迁移情况。现报告如下。

1　材料与方法

1.1材料低糖DMEM和高糖DMEM购自Gibco公司；血清购自Excell公司；小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(mAb)、小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb和小鼠抗大鼠Bax mAb购自Immuway公司；MTT四甲基偶氮唑蓝试剂购自碧云天生物技术公司；成骨、成脂诱导液以及碱性磷酸酶(ALP)和油红O染色液购自广州赛业公司；凋亡试剂盒购自Sigma公司；Transwell小室、6孔板、25 cm2细胞培养瓶购自Corning公司；倒置显微镜购自Nikon公司；二氧化碳孵育箱购自Thermo公司。

1.2hUC-MSCs的分离、培养及hUC-MSCs细胞培养液的制备在超净工作台中无菌操作，用PBS冲洗掉脐带表明残留的血液，在含双抗(青/链霉素，终浓度为100 U/mL)的营养液中浸泡约15 min，随后去掉脐带组织中的动脉和静脉，将脐带组织剪成约1 mm3的小块，小心均匀的贴在10 mm×35 mm小皿中并加入含有双抗的L-DMEM培养液，放在37 ℃、5%CO2孵箱内培养，每3 d换液1次。培养7～10 d可见纤维样的细胞从脐带组织块中爬出，待细胞融合到80%时消化传代。经过3次传代纯化后收集细胞备用。将hUC-MSCs细胞以5×105个细胞密度，接种于培养瓶中，待细胞融合度达到80%时，更换无血清的L-DMEM培养液，24 h后提取培养液,0.22 μm滤膜过滤。-20 ℃保存备用。

1.3 SKOV3细胞分组及hUC-MSC细胞培养液应用 将体外培养的SKOV3细胞分为观察1组、观察2组和对照组。观察1、2组分别用10%、20%的hUC-MSC培养，对照组用正常培养基培养。

1.4各组SKOV3细胞增殖情况观察 ①MTT法。取对数期生长的SKOV3接种于96孔板，每孔2 000个细胞，然后每孔加入200 μL H-DMEM营养液，37 ℃、5%CO2培养过夜后，次日换10%、20%的hUC-MSCs培养液(分别计为观察1组、观察2组)继续培养24 h，每孔加入20 μL MTT，37 ℃、5%CO2孵育箱培养4 h后弃掉上清培养基，每孔加入150 μL DMSO溶液，避光振荡15 min，酶标仪检测490 nm处的吸光度值。每个观察组设4个复孔。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞作为对照组。实验重复3次。②细胞平板克隆实验。取对数期生长的SKOV3细胞按500/孔接种于小皿中，用H-DMEM营养液培养过夜后，换10%、20%的hUC-MSCs培养液(分别计为观察1组、观察2组)，每3天换液1次，第7天弃去培养液，用PBS洗涤3遍后4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3遍，结晶紫染色30 min后PBS冲洗3遍，拍照并记录细胞克隆个数。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞作为对照组。实验重复3次。

1.5各组SKOV3细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。收集对数生长期的SKOV3细胞，0.25%胰酶消化计数，按每孔加入3×104个细胞于6孔板内，次日弃去培养液，换10%、20%的hUC-MSCs培养液继续培养24 h，收集细胞并计数每管1×106个细胞，然后滴加PI和Annexin-V-FITC进行双染，在4 ℃避光染色30 min，过滤后用流式细胞仪检测细胞凋亡率。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞为对照组。

1.6各组SKOV3细胞迁移情况观察 ①划痕实验。取对数期生长的SKOV3细胞按1×105/孔接种于小皿中，置于37 ℃、5%CO2孵育箱培养到细胞融合度>80%，弃去培养液，用无血清的H-DMEM营养液冲洗3遍，用200 μL移液枪枪头在小皿中划出1条直线，再用无血清的H-DMEM营养液冲洗，换10%、20%的hUC-MSCs培养液(分别为观察1组、观察2组)，在显微镜下观察并拍照记录0 h和48 h细胞迁移情况，计算0 ～48 h划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h宽度-48 h宽度)/0 h宽度×100%。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞为对照组。②Transwell迁移实验。用10%、20%的hUC-MSCs培养液预处理SKOV3细胞24 h，分别为观察1组、观察2组。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞为对照组。收集各组SKOV3细胞，用无血清H-DMEM营养液培养液重悬后，在Transwell小室中加入细胞悬液按200 μL，在下室中加入800 μL含10%NBS的H-DMEM营养液。置于37 ℃、5% CO2孵箱内培养12 h后，取出Transwell小室，吸去上室内的液体，棉签擦去小室内未迁移的细胞，用PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3遍，结晶紫染色30 min后PBS冲洗3遍，显微镜下随机选取视野拍照，计数每个视野下的细胞数。

1.7各组SKOV3细胞Bcl-2和Bax蛋白检测采用Western blotting法。用10%、20%的hUC-MSCs培养液预处理SKOV3细胞24 h，分别计为观察1组、观察2组。以未经hUC-MSCs培养液处理的SKOV3细胞为对照组。收集各组SKOV3细胞在RIPA缓冲液中裂解并收集蛋白，用12%SDS-PAGE电泳分离(最佳分离范围12～60 kD)，随后电转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入抗小鼠抗大鼠Bcl-2 mAb(1∶200)和Bax mAb(1∶200)以及内参照GAPDH抗体(1∶5 000)，4 ℃孵育过夜，用TBS/T洗3遍，加入HRP标记的羊抗小鼠IgG(1∶2 000)，室温孵育1 h，用TBS/T洗3遍，最后加入ELC试剂，拍照分析。Bcl-2、Bax蛋白表达量以Bcl-2和Bax条带灰度值与GAPDH条带灰度值的比值表示。

2　结果

2.1各组细胞增殖活性比较①观察1组、观察2组、对照组吸光度值分别为0.50±0.09、0.80±0.06、0.21±0.04。观察1、2组吸光度值均大于对照组(P均<0.05)，且观察2组大于观察1组(P<0.05)。②观察1组、观察2组、对照组细胞克隆数分别为(311.00±17.52)、(476.33±20.60)、(147.00±9.17)个，观察1、2组细胞克隆数明显高于对照组(P均<0.05)，且观察2组高于观察1组(P<0.05)。

2.2各组细胞凋亡率比较 观察1组、观察2组、对照组细胞凋亡率分别为10.98%±1.28%、5.50%±0.67%、17.97%±1.50%。观察1、2组细胞凋亡率低于对照组(P均<0.05)，且观察2组低于观察1组(P<0.05)。

2.3各组细胞迁移能力比较 ①观察1组、观察2组、对照组细胞划痕愈合率分别为114.50%±19.09%、138.50%±0.71%、108.50%±14.85%。观察1、2组细胞划痕愈合率高于对照组(P均<0.05)，且观察2组高于观察1组(P<0.05)。②观察1组、观察2组、对照组穿膜细胞数分别为155.00±151.50、335.67±344.50、151.33±145.50。观察1、2组穿膜细胞数高于对照组(P均<0.05)，且观察2组高于观察1组(P<0.05)。

2.4各组细胞Bcl-2、Bax表达比较观察1组、观察2组、对照组细胞Bcl-2相对表达量分别为0.48±0.47、0.62±0.63、0.84±0.86，Bax相对表达量分别为0.75±0.78、0.64±0.63、0.58±0.56。观察1、2组细胞Bcl-2相对表达量高于对照组(P均<0.05)，且观察2组高于观察1组(P<0.05)；观察1、2组细胞Bax相对表达量低于对照组(P均<0.05)，且观察2组低于观察1组(P<0.05)。

3　讨论

hUC-MSCs具有取材方便来源广泛、免疫原性低、分泌多种细胞因子和免疫调节能力强等特点，是目前研究最多最深入的干细胞之一[7,8]，hUC-MSCs有望成为理想的细胞工程“种子细胞”。hUC-MSCs获取的主要方法是贴壁法和酶消化法，但由于酶消化法操作步骤多，污染风险大以及对细胞有伤害。本研究通过脐带组织贴壁法分离hUC-MSCs，传代培养获得纯化的hUC-MSCs。

越来越多研究[9～11]表明肿瘤微环境在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。MSCs能够受到炎症因子的趋化迁移到炎症组织处并对其进行修复[12]，目前研究发现肿瘤的微环境与炎症周围的微环境有许多相似之处，MSCs同样能够被招募到实质肿瘤部位构成其微环境，微环境中的MSCs能够进一步成为肿瘤相关成纤维细胞，并参与肿瘤生长、侵润转移和耐药等过程。研究人员发现,hUC-MSCs培养液对肿瘤细胞的增殖和迁移有促进作用[13]，并推测这方面的作用可能是通过hUC-MSCs分泌的细胞因子实现的。本研究结果显示，与对照组相比，观察1、2组SKOV3细胞增殖和迁移能力增强，细胞凋亡率降低，且观察2组比观察1组显著，提示hUC-MSCs通过旁分泌途径促进了SKOV3细胞的增殖和迁移并抑制其凋亡。McLean等[14]在分离肿瘤相关MSCs时发现有90%的原发性卵巢癌患者存在肿瘤相关MSCs，但是这些MSCs没有致癌性，具有正常的核型和细胞表面标记以及多向分化潜能增强。Chu等[15]发现从健康人网膜中分离的脂肪来源MSCs能够明显促进卵巢癌细胞生长和迁移。另外，So等[16]发现，卵巢癌细胞与其微环境中的MSCs相互影响，MSCs通过分泌IL-6作用卵巢癌细胞发生上皮间质转化，使卵巢癌细胞获得间质特性，此外还分泌基质金属蛋白酶增强肿瘤的侵袭和转移能力。不过也有研究发现MSCs能够抑制卵巢癌的增殖迁移能力[17,18]，这些结果的不一致可能是由于MSCs来源不同以及所使用的卵巢癌细胞株不完全一致。

Bax和Bcl-2是Bcl-2家族中重要成员，Bcl-2发挥促增殖和抑制下游凋亡途径的激活作用，而Bax能够与Bcl-2形成二聚体拮抗Bcl-2的促增殖作用，从而激活下游凋亡途径。正常情况下，Bax和Bcl-2相互协调维持平衡，但如果受到体内或是外部的刺激，将打破这个平衡导致机体功能紊乱。本研究结果显示，与对照组相比，观察1、2组SKOV3细胞Bcl-2表达升高，Bax表达下降，且观察2组比观察1组明显，提示在hUC-MSCs细胞培养液中培养，SKOV3细胞Bax的表达下调，Bcl-2表达下调，这可能是与各组细胞细胞增殖、凋亡、迁移能力的变化有关。

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