促红细胞生成素对高氧诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的预防作用及其机制

党嘉文，董文斌，雷小平，康兰，李清平，何娜

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

高氧肺损伤的确切机制至今仍未阐明。肺泡上皮细胞凋亡是高氧肺损伤的一个重要组织学特征[1,2]，细胞凋亡的发生与胞质内线粒体形态的动态变化存在密切联系[3]。而与线粒体形态变化相关的神经萎缩症蛋白 1(OPA1)是凋亡前期诱导因子[4]。近年大量研究[5～8]结果证实，促红细胞生成素 (EPO)是细胞因子超家族成员之一, 通过抗细胞凋亡、抗氧化应激、促血管生成、调节炎症等对抗多种组织损伤。但是EPO预处理是否可以预防高氧肺损伤目前尚未见报道。本研究用高体积分数氧处理人肺泡Ⅱ型细胞A549建立新生儿高氧肺损伤模型[9]，观察EPO预处理对高氧肺损伤的预防作用，并探讨其机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1细胞、仪器及试剂人肺泡上皮细胞A549由西南医科大学附属医院中心实验室提供；LX71型倒置相差显微镜购自Olympus公司；JEOI-1400透射电子显微镜购自JEOL公司；FORMA311型CO2培养箱购自Gibco公司；EPO购自成都地奥九泓制药厂；CCK-8购自日本同仁化学研究所；ANNEXIN V流式细胞凋亡检测试剂盒购自凯基生物公司；OPA1多克隆抗体(兔抗人)购自R&D公司；SP免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司；线粒体膜电位检测试剂盒购自Biovision公司。

1.2 细胞分组及EPO应用方法 先将人肺泡上皮细胞A549复苏,加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时用0.25%的胰蛋白酶进行消化,传代培养。设观察1、2、3、4组及模型对照组、空白对照组。观察1、2、3、4组细胞分别加入10、20、50、100 IU/mL的EPO预处理24 h，然后置于氧浓度>90%的高氧培养箱内培养24 h。模型对照组细胞直接置于氧浓度>90%的高氧培养箱内培养24 h。空白对照组细胞常规条件下培养24 h。收集细胞进行如下研究。

1.3各组细胞增殖情况观察采用CCK-8法。按试剂盒说明操作，酶联免疫检测仪测定450 nm波长处的各组光吸收值(以OD450表示)。

1.4各组细胞凋亡情况观察 各组细胞培养24 h,后收集细胞,用流式细胞仪检测,按照凯基ANNEXIN V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。

1.5各组细胞形态观察采用倒置相差显微镜下观察细胞形态学变化。

1.6各组细胞线粒体形态观察采用JEOL-1400透射电镜观察线粒体形态变化。

1.7各组细胞OPA1 检测方法 采用免疫组化法检测观察4组、模型对照组和空白对照组细胞中的OPA1。实验中OPA1蛋白抗体的稀释度为1∶200。按照说明书进行操作,细胞质染成棕黄色为阳性表达。实验重复3次,每张爬片任选8个高倍镜图片,在倒置相差显微镜下观察细胞,采用Image-pro6.0图像分析软件对图像进行分析,测定IOD值。

1.8各组细胞线粒体膜电位检测方法 采用四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物 (JC-1) 检测观察4组、模型对照组和空白对照组细胞线粒体膜电位。3组细胞置于激光共聚焦显微镜下观察。设置激发波长为488 nm, 发射波长为530 nm及590 nm，分别观察绿色和红色荧光。计算机采集图像荧光值, 计算红绿荧光强度比值。红绿荧光强度比值=红色荧光强度/绿色荧光强度。

2　 结果

2.1各组OD450比较观察1、2、3、4组及模型对照组、空白对照组OD450分别为0.21±0.03、0.28±0.02、0.32±0.03、0.34±0.04和0.16±0.04、0.37±0.06。模型对照组OD450与空白对照组相比，P<0.05；观察1、2、3、4组OD450与模型对照组相比，P均<0.05；观察1、2组OD450与空白对照组相比，P均<0.05；观察3、4组OD450与空白对照组相比，P均>0.05。

2.2各组细胞凋亡率比较 观察1、2、3、4组及模型对照组、空白对照组细胞凋亡率分别为3.70±0.66、2.31±0.54、1.08±0.49、1.13±0.51和5.24±0.93、0.95±0.37。模型对照组细胞凋亡率与空白对照组相比，P<0.05；观察1、2、3、4组细胞凋亡率与模型对照组相比，P均<0.05；观察1、2组细胞凋亡率与空白对照组相比，P均<0.05；观察3、4组细胞凋亡率与空白对照组相比，P均>0.05。

2.3各组细胞形态学变化 倒置相差显微镜下空白对照组细胞为扁圆的多角形，悬浮细胞较少，细胞排列紧密，连接成片，呈良好的生长状态。模型对照组细胞受损明显，变为圆形或椭圆形，细胞间空隙加大，活细胞数量明显降低，悬浮细胞明显增多。观察1、2、3、4组随EPO浓度增加 ,细胞损伤状况与模型对照组相比明显改善。观察3、4组细胞形态与空白对照组相似。

2.4 各组细胞线粒体形态变化 透射电子显微镜下可见模型对照组细胞大量线粒体肿胀或破裂，线粒体的数量增多，并可伴线粒体嵴数减少或消失、染色质浓缩、细胞核裂解为碎块等细胞凋亡特征。观察1、2、3、4组线粒体断裂情况有所恢复，观察3、4组细胞线粒体断裂情况与空白对照组相似。

2.5 各组细胞OPA1比较 OPA1染色阳性表现为胞质出现棕黄色颗粒。观察4组、模型对照组、空白对照组OPA1的 IOD值分别为23.01±2.01、7.53±1.16、38.25±6.67。观察4组OPA1的 IOD值与空白对照组和模型对照组相比，P均<0.05。

2.6 各组细胞线粒体膜电位比较 观察4组、模型对照组、空白对照组红绿荧光强度比值分别为1.73±0.06、1.32±0.07、1.96±0.84。观察4组红绿荧光强度比值与空白对照组和模型对照组相比，P均<0.05。

3　 讨论

线粒体途径是细胞凋亡的主要途径及中心环节[10，11]。线粒体形态和功能的稳定对肺部疾病的发生发展起着直接作用。线粒体在细胞内形态的维持是通过线粒体融合和分裂实现的[12]，而线粒体的结构与功能密切相关，线粒体膜电位是评价线粒体功能完整性的敏感指标[13]。线粒体在凋亡信号诱导下，跨膜电位下降，通透性改变，细胞色素C等凋亡执行因子释放入胞质，继而线粒体发生碎片化，完整性被破坏，融合功能也同时被抑制，导致细胞凋亡[14]。本研究结果显示，模型对照组细胞增殖活性下降，细胞凋亡率升高，线粒体外膜肿胀或破裂，线粒体嵴数量减少或消失，线粒体膜电位下降。证实高氧可诱导A549细胞凋亡，且凋亡的发生与线粒体形态和功能改变密切相关。

线粒体的分裂和融合是由特定的功能蛋白介导的，OPA1 是调控线粒体融合的关键蛋白，当其功能损伤时，可导致线粒体分裂和融合的动态平衡下降，线粒体外膜肿胀或破裂，线粒体嵴数量减少或消失，线粒体膜电位下降，线粒体碎片化，引起细胞凋亡[15]。本研究结果显示模型对照组细胞OPA1 表达较正常对照组显著降低，提示高氧可抑制A549细胞内 OPA1蛋白表达，使线粒体融合被阻断，线粒体完整性被破坏，导致细胞凋亡。对于高氧肺损伤的防治，临床上主要集中在合理用氧，如更换机械通气模式、运用保护性通气策略，但收效甚微，寻找一种有效的药物来阻断高氧肺损伤已迫在眉睫。故本研究采用外源性生长因子 EPO干预，结果发现，各观察组A549细胞凋亡率随 EPO浓度升高而降低，100、50 IU/mL的EPO能显著降低高氧所致A549细胞的损伤，与对照组比较无统计学差异。EPO 是通过与红细胞生成素受体 (EPOR)结合发挥作用。EPOR在多个器官都有表达, 肺是其靶器官之一[16]，受体的生物效应与被占领受体的量呈正比，故本研究中其保护效应随EPO浓度的增加而增强。而受体与配体结合又具有饱和性，故在 EPO浓度达到 50 IU/mL后 ，其保护效应达到饱和。同时，本研究结果还显示，EPO可上调A549细胞内线粒体融合蛋白OPA1表达水平，抑制线粒体膜电位下降，因此推测EPO可能通过增强OPA1蛋白表达，稳定线粒体膜电位来明显减轻高氧诱导的肺泡上皮细胞凋亡，但具体的机制尚需进一步研究。

参考文献：

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