茶树组培技术研究进展

岳翠男 王治会 江新凤 杨普香

(江西省蚕桑茶叶研究所 330202)

植物组织培养指离体条件下利用人工培养基对植物器官、细胞、组织以及原生质体等进行培养，使其成长为完整植株。Schleiden and Schwann(19世纪40年代)最早创立细胞学基础。Haberlandt(20世纪初)提出高等植物的器官、组织可以不断分割直到成为单个细胞，其还尝试组织培养的试验，由于受当时实验条件的限制，在培养的过程中只发现细胞的生长和细胞壁加厚，但并没有细胞分裂的现象。White用番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使植物的离体培养首次获得成功。经过国内外学者们试验和研究，组织培养技术逐渐成熟，在植物育种、植物脱毒和离体快繁、生产次生代谢产物、植物种质资源保存和交换、遗传、生理生化和病理等领域得到广泛应用[1～3]。

茶树的组织培养技术始于20世纪60年代英国剑桥大学化学实验室用离体的茶树嫩茎研究咖啡碱合成[4]；吴振铎(20世纪70年代中期)以茶树子叶为外植体，成功获得茶树再生试管植株，20世纪60年代末胜尾清等对茶树花药进行培养并诱导其分化[5～6]，随后，众多学者分别以茶树的不同器官为外植体，获得茶树植株[7～10]。目前，组培技术在茶树中的应用主要有茶树快速繁殖、种质资源保存和生产次生代谢产物等。本文就组培技术在茶树中的应用进行梳理，以期为茶树组培技术的应用和发展提供参考。

1 茶树离体快速繁殖技术

茶树离体快速繁殖的主要优点就是“快”，且材料来源单一、遗传物质均一、不受季节和空间的限制，同时，对于有病毒的植株，还可以达到脱毒的效果。目前茶树离体快繁主要体现在组织器官离体培养、茎尖分生组织离体培养以及原生质体培养[11～12]。

1.1 茶树器官培养

1.1.1 茶树花药的培养

茶树器官离体培养主要是以茶树的花药、腋芽、根、茎、叶片和子叶等为外植体进行培养。胜尾清对茶树花药进行培养并诱导其分化，但仅分化出根[6]。陈振光等[13]以9个茶树品种的花药为外植体，经诱导、分化和移栽，只有福云7号形成完整的单倍体植株，且均无二倍体植株。杨娟等[14]以不同品种以及同一品种不同阶段的茶树花药为外植体，研究其诱导为愈伤组织并分化出根的主要影响因素，结果表明，当茶树花处于花苞状态时，诱导为愈伤组织的效率最高且品种间也存在一定的差异，而生长素浓度与出愈率呈“钟型”关系，植物激素可以诱导愈伤组织分化出根。以花药为外植体进行组培育种，具有后代纯、时间短、选择效率高和遗传稳定的优势，花药培养的优势对于珍稀茶树品种的繁育具有重大意义。

1.1.2 茶树种子的培养

茶树种子包括种皮与果皮、胚乳、子叶、胚芽、胚轴和胚根。Roy[15]分别以种子未成熟子叶(9月采摘)和成熟子叶(11月采摘)为外植体进行组织培养，研究发现，未成熟的子叶体细胞胚胎发生率可达40%，而成熟的子叶仅仅有18%，外源激素2,4-D、IAA、NAA、PBOA、BAP和激动素等均会影响体细胞胚胎的发生率，在培养基中添加1 mg/L的PBOA和BAP或激动素5 mg/L可以诱导体细胞胚胎发生率达到最大，胚芽转换率最高到达42%，在温室条件下，采用有土盆栽的方法，植株成活率在60%～70%。在幼苗移栽时，添加外源活性菌可以显著提高其成活率[16]。Akula等[17]以茶树种子为外植体，发现在MS培养基中添加甜菜碱可以有效加速和提高体细胞胚胎的诱导率，其中，诱导率和甜菜碱的浓度呈线性正相关，此外，在培养基中加入ABA后，可以和甜菜碱呈协同效应。黄燕芬[18]通过未成熟胚获得芽苗和子叶柄，并以其为外植体，在改良MS培养基中可以较好地诱导出愈伤组织并分化出芽，通过继代培养39天，可以长出幼苗，其中83%为有效苗，研究也表明带芽的愈伤组织增殖效果比带腋芽的茎块效果要好。刘本英等[19]将云南大理茶和福鼎大白茶作为母本和父本，得杂种F1代，以其幼胚为外植体进行组织培养得到幼苗，通过ISSR分子标记，证明F1代和父本、母本均有共同条带，证实其为杂种后代；但将部分杂交种子田间播种，结果发现种子萌发率为零，说明组织培养技术可以克服远缘杂交的繁殖率问题。

1.1.3 茶树腋芽的培养

腋芽是真叶的重要组成部分，也是离体培养的常用外植体。Agarwal等[20]用茶树顶芽和腋芽为外植体，在形态学发生的不同阶段，添加相应的外源激素和营养剂，1～2周后，外植体延长，6～7天，嫩枝长出1.0～1.5 cm，9～10周后，外植体离体繁殖，最终生长出完整的植株。Borchetia等[21]以茶树品种(阿萨姆种、柬蒲塞种和中国种)、培养基(MS、WPM、White’s和SH)、外植体(茎尖、腋芽和子叶)为变量，研究茶树离体快繁的影响因素，结果表明，采用MS培养基所需时间最短；柬蒲塞种的繁殖率相对较高；茎尖的分生能力较腋芽和子叶的强，但腋芽是微体繁殖中保持亲本最安全的材料；采用随机多态性分析表明，通过这三种外植体培育出的植株与亲本基因型的相似度在80%以上，在亲本基因型保真度方面，腋芽的最高。Sandal等[7]报道在液层培养基中添加N-苯基-N-1,2,3-噻二唑-5-脲(TDZ)可以促进腋芽培养的增殖率，减少玻璃化、黄化和愈伤组织坏死。韦景枫等[22]采用单因素试验法建立茶树腋芽组培的最佳条件，腋芽诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L，增殖培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L，生根培养基为1/2 MS+IBA 0.3 mg/L，其繁殖倍数可达4～5倍，生根率达90%。在茶树腋芽培养过程中，要防止褐化现象，有研究表明，低起始温度可以有效降低褐化率[23]。在茶树腋芽离体培养中，易长出大量健康的丛生芽，且丛生芽有较强的遗传稳定性和较高的繁殖系数[24]，可以有效地保留亲本的优良性状，这对茶树良种的扩繁具有重要意义。

1.1.4 茶树叶片的培养

叶片常被作为诱导愈伤组织和胚状体的外植体[24]。Kato[25]以未成熟的茶树叶片为外植体，用含有不同2,4-D水平的MS培养基进行培养，研究发现，在高细胞分裂素条件下，培养4～6周就会长出4～5片对夹叶；体细胞胚胎可以通过叶片基部培养直接发生，也可以通过胚性愈伤组织形成；胚胎发生与茶树叶片的成熟度相关，叶龄小，易获取胚胎体细胞，2,4-D的作用周期与胚胎的形成也有一定的相关性。Sandal等[26]以茶树叶片为外植体，采用相似的试验方法研究2,4-D对其微繁过程中形态学发生的影响，结果表明，在预设2,4-D水平下，均可生根，其极限阈值为2.54 mg/L；延长培养到15周后，在高浓度2,4-D(7.5mg/L和10mg/L)环境下形成不定芽，低浓度下(2.5mg/L和5mg/L)没有观测到芽。陈菁[27]分别以茶树带腋芽的茎段、顶芽和叶片为外植体进行组织培养，发现顶芽的污染率最低，但由于其绒毛含量高，不易消毒，导致其死亡率高；叶片的老嫩度不均一，消毒时间不易控制，而引发其死亡率高；相对而言，茎段是较好的外植体材料。欧少云等[28]以茶树嫩叶为外植体，研究外援激素的种类以及浓度对愈伤组织形成的影响，结果表明，在附加有2.0 mg/L的6-BA和1.0 mg/L的NAA的1/2MS培养基中效果最好，其诱导率达到86.7%。研究发现，茶树叶片的酚类物质含量高，在其诱导分化过程中，易引起褐变，导致诱导成功率低。

1.1.5 茶树嫩茎的培养

茎段是较为理想的离体微繁外植体，具有培养期短、繁殖率高的优点，可以明显缩短育种年限且获得愈伤组织的诱导率最高[29～30]，茶树茎段作为外植体时，最佳取材时间为5月、6月、9月，最佳部位为半成熟新梢的未木质化部位[31]。茶树茎段的诱导分化需要8周以上，其分化后，多种培养基交叉培养比单一培养维持其分化能力的时间长[32]。据张亚萍[33]研究表明，茶树茎段较叶片的出愈率高、根诱导率高，带腋芽的茎段分生能力强，可以更为容易地获得转化苗。Frisch等[34]报道了外源激素对茶树嫩茎诱导愈伤组织的影响，在MS培养基中添加2,4-D、2,4,5-T、NAA和毒莠定均可促进愈伤组织的生长，当没有激动素时，毒莠定可以更好地促进愈伤组织增殖；采用因子试验优化得到外源激素的最佳参数为10-7mol/L的2,4-D、10-6mol/L的2,4,5-T、10-7mol/L的毒莠定、10-8mol/L的NAA、10-5mol/L的激动素。Seran等[35]以茶树茎段为外植体，在含有生长调节剂的MS培养基上诱导培育，结果表明，5周后分化出叶片，16周后体细胞胚胎发生，在培养基中添加外源激素，可以促进子叶下胚轴的分化频率。张娅婷[36]对带腋芽茎段薮北种进行组培研究表明，诱导愈伤组织的最佳培养条件为含有2.0 mg/L的MS培养基，诱导生根的最佳培养条件为附加有BA1.0mg/L和IBA0.2mg/L的MS培养基，幼苗苗长2～3 cm、根数2～3条时移栽，用泥炭土作基质可以提高成活率。茶树嫩茎是茶树离体快繁的优良材料，可以为珍稀品种的再生提供有效途径，缩短育程，但目前的茶树组培技术尚不够稳定。

1.2 茶树原生质体培养

植物原生质体是除去细胞壁后裸露的球形细胞团。因其没有细胞壁，相对比较容易摄取DNA、染色体、细胞器、病毒颗粒等外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体；是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料；也可以通过诱导形成杂种细胞，为创新杂种开辟途径。原生质体培养技术主要包括分离和培养、原生质体融合和无性系变异筛选、离体诱变及遗传转化等方面。

Gunasekare等[37]报道相同成熟度不同位置叶片，原生质体的产量几乎没有差异，原生质体的活力受酶的组成影响，在最佳条件下，原生质体的产量为11%，每克鲜叶可以获得3×106～4×106个原生质体(通过面积粗算法得出)。彭章等[38]发现以茶树实生苗的幼嫩叶片、茶树种子萌发后的幼嫩胚根、茶树健康生长5周以内的幼嫩叶片为外植体时，实生苗幼嫩叶片分离出原生质体的效果最佳，其酶解液是1.5%纤维素酶、0.1%离析酶、0.5%果胶酶、0.4mol/L甘露醇和20mmol/LMES，酶解分离时，宜采用低速(50rpm左右)震荡培养，时间控制在7～8 h，采用40% PEG-6000诱导20min可使原生质体诱导率达到10%。Yoriyuki[39]以茶树的叶片、花瓣以及继代一周的愈伤组织为材料，分离原生质体，结果表明，花瓣分离出的数量最多且完整度最高，用浓缩酶液可以促进分离效果。茶树原生质体的分离与外植体的类型以及其切割方法(横切、纵切以及大小)、培养参数有着密切关系。茶树多酚含量较高，在分离培养过程中，易引起原生质体褐变而影响试验结果[40]，因此在分离茶树原生质体时，最好选用多酚含量低的材料。原生质体的融合是培育出新植株的关键步骤，目前，关于茶树原生质体成功融合并分化出幼苗的技术还比较匮乏。

2 茶树种质资源离体保存

传统的资源保存方法有种子保存和种植保存。种子保存法占用体积小，操作相对较为简单，但是，随着保存时间的延长，其活力逐渐下降，还存在病虫害的威胁，而且大部分种子为杂合子，其亲本的遗传稳定性不能得到保障。种植保存法成本高，易受环境威胁。茶树种质资源离体保存是以组织培养为基础，对已建立好的、具有完全再生能力的培养物，如原生质体、愈伤组织、胚、花药和茶树试管苗等进行特殊保存。植物种质资源离体保存主要有超低温(低于负80℃)保存和低温保存，其中，低温保存分常温25±5 ℃、常低温0～15 ℃和低温-80～0 ℃[41～43]。

Yoriyuki等[39]采用液氮超低温的方法保存茶树的种子和下胚轴，结果表明，正常含水量的种子在超低温条件下很难保存；脱水处理的种子，活性严重下降而不利于资源的保存；种子的下胚轴在超低温条件下，得到有效的保存。Kuranuki等[44]采用玻璃化技术，通过包裹或脱水超低温手段保存茶树茎尖，发芽率达到40%。刘亚军等[45]报道悬浮细胞玻璃化超低温的最佳保存与复温解冻条件，即：预培养4天，60% PVS2 冰浴装载20 min，100% PVS2冰浴脱水处理60 min，40℃复温解冻，试验的细胞存活率达到 76%。李振刚[46]研究金凤凰试管苗的离体保存技术，试验表明，在1/2MS培养基上添加15 g/L的甘露醇，使试管苗存活率达到82.2%，最适的继代培养基是1/2MS培养基+30 g/L蔗糖+PP333 20 mg/L+ABA 0.5mg/L。

3 次级代谢产物的生产

茶叶含有茶多酚、咖啡碱、茶氨酸等多种天然生物活性成分，逐渐被各行各业发现和利用。在自然条件下，茶叶中的次级代谢产物相对较低，尤其是咖啡碱和茶氨酸，分别只有1%～4%和1%～2%，提纯难度大、生产成本高，导致利用率低、推广度小[47]。近些年，国内外一些学者通过茶树组织培养的手段来富集茶树次级代谢产物，并获得成功。

Matsuura等[48～49]通过茶树嫩茎获得愈伤组织，并用含有氮源的培养基继续培养，经检测分析表明，组织中的茶氨酸干物质含量增加到22.3%，茶氨酸合成量与愈伤组织的生长情况呈正相关，谷氨酸的含量没有明显变化，而谷氨酰胺的含量显著降低，但其减少量低于茶氨酸的增加量，说明细胞中的茶氨酸是通过多种途径合成的。华萍等[50]以茶树嫩芽为外植体获得悬浮愈伤组织，结果表明，在NH4+:NO3-1.0 :60.0 mmol /L、K+100.0 mmol L、 Mg2+3.0mmol L、 H2PO4-3.0 mmol L、 蔗糖 30.0 g/ L、 水解酪蛋白 2.0 g /L 条件下，茶树细胞的生长量和茶氨酸的积累量均达到最高值，培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度直接影响到细胞对数生长期和稳定期，从而影响茶氨酸的积累量，H2PO4-影响细胞生长速率和茶氨酸合成速率的同步性，Mg2+会影响茶氨酸合成酶的活性。在一个培养周期中，茶氨酸的积累高峰期在第10天左右，如果每10天继代培养一次，茶氨酸的合成能力维持30天左右，茶氨酸的积累量达20%[51]。黄皓[52]采用正交试验法研究茶叶悬浮细胞生长率和儿茶素产率的最佳工艺参数，摇床转速80 rpm、装液量30 mL、接种量1 g，在此条件下，细胞增值率3.77倍，悬浮细胞中儿茶素含量达到57.83 mg/g DCW，儿茶素组分为EC、ECG、EGC。

4 结语

茶树组织培养在新品种的繁育、种质资源保存以及次级代谢产物的积累方面具有重要作用。原生质体育种，可以克服远缘杂交不亲和、雄性不育。目前，国内外关于茶树组织培养技术的研究更多还是处于基础阶段，茶树的离体再生技术还处于瓶颈期，分化出幼苗的效率还比较低，生产成本较高，茶树离体保存技术未得到推广。在茶树组培方面，建立稳定的体细胞胚胎发生和高频的植株再生系统的工作还需完善；激素类的调控研究还需加强；需要构建更优的技术方案来提高组培苗的转化效率；同时还需加强对珍稀茶树资源的离体保存，丰富茶树品种库。