植物内生菌研究进展

方珍娟 张晓霞 马立安

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025) (中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100089) (长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

植物内生菌是指其生活史的一定阶段或全部阶段定殖于植物器官、组织内部以及细胞间隙的微生物，被感染的植物(至少是暂时)不表现出明显的症状。根据对宿主植物造成的影响，植物内生菌可分为：内共生微生物和病原微生物；根据种类将植物内生菌分为真菌、细菌、放线菌，可以通过组织学方法从表面彻底消毒后的植物组织中分离出微生物或通过从表面消毒后的植物组织中扩增到微生物核DNA证实其存在[1～7]。植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。直到20世纪30年代，由于牲畜食用了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。内生菌一词“endophyte”最早是由德国科学家DeBarry于1886年提出[8]。1992年，Mcinroy等[9]认为植物内生菌是指能够定殖在植物细胞间隙或细胞内，并与寄主植物建立和谐联合关系的一类微生物，并首次提出了“植物理内生细菌”的概念，他认为能在植物体内定殖的致病菌和菌根菌不属于内生菌。近年来，随着研究领域的不断拓宽和研究方法的不断深入，植物内生菌所发挥的重要的生态和生理作用及其作为潜在生防资源和外源基因载体，在农业和医药领域中具有巨大应用潜力，已逐渐成为国内外研究的热点[1]。

1 植物内生菌的来源

关于植物内生菌的来源目前主要有3种假说：(1)垂直传播，由同种植物经种子传播；(2)水平传播途径，外界微生物将植物细胞纤维素降解破坏植物的细胞壁，进入了宿主植物；(3)从植物侧根的裂缝中根际菌进入到植物，经过长期的协同进化，与植物建立了和谐的内生关系，成为内生菌[4～7]。对分离到的植物内生菌分解纤维素情况研究表明，很多内生菌能够利用纤维素为惟一碳源生长。这说明一些植物内生菌可能是通过分解植物表皮和细胞壁进入植物，并且可能利用植物组织中的纤维素为碳源，以维持生长活动的需要。也有研究结果表明，在长期协同进化过程中，植物有选择地保留了一些具有重要生态学功能的内生菌菌株，并通过种子进行垂直传播，从而使后代获得一些重要的、由内生菌赋予的性状和功能[1]。

2 植物内生菌的多样性及其影响因素

植物内生菌是一个庞大的微生物类群，其种类繁多，分布于不同寄主植物的不同部位，因此能产生多种不同的代谢产物，具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫、免疫抑制、抗氧化和降糖等活性。植物内生菌多样性是宿主生理状态的评价标志之一，主要包括内生菌自身种类多样性、寄主植物种类多样性、内生菌在寄主植物不同部位分布多样性[1～4]。

2.1 内生菌种类多样性

目前全世界已在80多个属[5,6]中290多种禾本科植物发现有内生菌，对于一种植物而言，从中可分离到的内生真菌和(或)细菌通常为几种至几十种，有的甚至多达几百种[1]。内生真菌存在于目前所有已研究的植物中[1～4]，大多数内生真菌都属于子囊孢子类(Ascomycetes)，包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes)和腔菌纲(Loculoas-comyetes)的许多种类以及它们的一些衍生菌[5]。在多种植物中广泛分布的几个属是半壳霉属(Leptostroma)、Cryptocline属、拟隐孢霉属(Cryptosporipsis)、拟茎点霉属(Phomopsis)和叶点霉属(Phyllosticta)[10]。牧草中的内生真菌主要集中在子囊菌亚门麦角菌科瘤座菌族(Balansieae)的Balansia(无性型为Ephelis)和Epichloe(无性型Neotyphodium)2属[2]。植物内生细菌是十分重要的内生菌资源，能在健康植物组织内定殖，通过多种作用影响植物生长和发育，与植物建立和谐联合关系[1]。目前已报道在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、基杆菌属(Methylobacterium)等。现在发现的内生真菌主要为子囊菌类(Ascomycet)及其无性型，包括核菌纲(Pyrenomyetes)、盘菌纲(Discomyetes)和腔菌纲(Loculoascomyetes)等[2]。目前对红树林、热带多年生树木及一些药用作物中植物内生放线菌研究较多，主要为链霉菌属(Streptomyces)、链轮丝菌属(Streptoverticillum)、游动放线菌属(Antinoplanes)、诺氏卡菌属(Nocardia)、小单胞菌属(Micromonospora)[1]。

2.2 宿主种类的多样性

毕江涛等[11]对沙冬青根瘤菌的研究发现，nodA基因的遗传多样性较高，其根瘤菌在结瘤方面具有较宽的宿主范围。从20世纪70年代后期以来，先后在一些重要的经济林木如针叶类的各种冷杉(Abiesspp.)、云杉(Piceaasperata)、红杉(SequoiasempervirensEndll)、松柏(Pinusseylvestris)等以及阔叶的栎树(Quercussp.)、桦树(BetulaL.)、桉树(Eucalyptusurophyll)等植物树皮、枝叶内发现内生真菌的存在，并进行了广泛的研究。后来在多种灌木和草本植物以及栽培作物、果树甚至藻类、苔藓和蕨类植物中也发现了内生真菌和内生细菌[4]。目前研究的关于微生态的植物已达上百种[3]，涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个类群，其中研究较多的植物有牧草、棉花(Gossypiumhirsutum)、小麦(Triticumaestivum)、高粱(Sorghumbicolor)、水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、马铃薯(Solanumtuberosum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、甜菜(Betavulgaris)等[2]。

2.3 分布部位的多样性

内生菌在植物体中的分布具有普遍性、多样性的特点。在目前研究过的所有植物中均发现有内生菌[4,5]，可存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子等器官和组织的细胞或细胞间隙等各个部位[6,7]。近年来，已从黄瓜(Cucumissativus)、甜菜根、甘蓝(Brassicaoleracea)、花生果仁(Archishypogaea)、百慕大草(Bermudagrass)的茎、马铃薯的块茎、种子和胚珠、棉花的胚根、棉铃和水稻叶及其他植物储藏器官内分离到大量内生细菌[12]。内生真菌菌丝在宿主植物的叶鞘和种子中含量最多，而叶片和根中含量极少[13]。比较植物不同器官和组织可以发现，不同的内生菌占据不同的生态位。不同植物中分离出的内生菌不同，它们在宿主植物科的水平上具有专一性。并且，内生菌在寄主的种以及组织水平上都存在专一性[14～16]。研究表明，内生菌具有一定组织专一性的原因可能是由于不同的内生真菌具有利用不同基质的能力，从而决定内生真菌具有不同的生活方式[17]。植物内生菌的分布与植物种类、基因型、营养供给、器官、生长阶段和环境条件有关[1,2]。

2.4 影响植物内生菌多样性的因素

随着植物种类、器官、生长阶段和环境条件的不同，其种类、数量会有所不同。不同地区、不同环境下生长的同一种植物组织中存在的内生菌种类和数目均有较大的差异，即使同一地区的同一植物不同组织部位中内生菌的数量和种类也不相同[10,18]；生长速度快的植物比生长速度慢的植物中内生菌数量多；不同植物中分离出的内生菌不同，同一种植物，其内生菌的种类和数量也会随植株生长时间增加而增多。健康植株比胁迫条件下的植株内生菌的种类和数量多。生物多样性越丰富的地区植物中内生菌的种类和数量也越丰富，生长在热带、亚热带地区的植物中内生菌的种类和数量就比生长在干燥、寒冷地区的植物中的要多[3]。我国浙江省农业科学院2003年至2005年对雷公藤(TripterygiunwilfordiiHook)、银杏、芦荟、辣椒等的研究表明，内生菌在林木组织中以根部最多，茎部次之，叶部较少，而在一年生和多年生的经济作物中，根部最多，叶茎中数量相近。生长时间久的植株其内生菌数量比生长时间短的植株多，古老的树种比其他植物中的内生菌多[19]。而何红等[20]从辣椒叶内分离到内生细菌的数量高于从根内分离到的细菌。菌根真菌的生长与植物种类、pH、土壤养分有着密切关系，菌根真菌的种类、数量、物种多样性、种群结构及其功能将随环境的改变而发生变化[9]。植物内生菌多样性受宿主植物类型、宿主生长阶段、外界环境等影响，并且在植物生长发育过程中起十分重要的作用[1,2]。

3 植物内生菌与宿主的关系

3.1 促进宿主植物的生长

内生细菌存在于植物体内，对植物本身的影响分3类：第一类是中性的，大部分内生细菌都属于这一类；第二类是有益的；还有一类属于有害的。植物内生菌与宿主表现出互利共生、无害或微害寄生等关系，并且这些关系可随多种因素的变化而相互转化。与宿主植物存在互利共生关系的内生菌能够促进植物的生长。内生细菌促生作用可分为直接和间接的促生作用，一般情况下，直接促生作用指内生细菌自身代谢产物如植物生长激素(IAA、吲哚乙腈)、赤霉素以及细胞激素等来促进植物生长[1,12]，或者提高寄主植物对环境中营养物质的吸收能力如溶磷能力、固氮作用以及产生铁载体、产生植物激素等；间接促生作用主要表现在非生物胁迫(抗高温、抗干旱、抗高盐)和生物胁迫(抗病虫害)的抗逆性[5]。非生物胁迫是指通过诱导宿主植物系统性抗性而产生的胁迫，生物胁迫是指通过内生菌分泌抗生物质、竞争生态位、竞争营养物质而产生生防作用。

3.1.1 溶磷解钾作用

磷肥施入土壤之后易形成难溶性的磷酸盐，植物对其利用率通常极低。同时，土壤中的钾元素含量较高，但主要以含钾矿物的铝硅酸盐形式存在，也难以被植物吸收利用。而自然界中某些微生物具有溶磷解钾作用，这些微生物既有内生菌也有非内生菌，其对植物矿物营养元素的吸收起着重要作用。研究表明，许多微生物能够将无机磷转化成可溶性磷或使有机磷发生矿化来促进植物对磷的吸收和利用[12]。

3.1.2 固氮作用

生物固氮是指固氮生物将大气中的氮气还原成氨的过程。固氮生物一般为肉眼不可见的微生物，所以，固氮生物又叫做固氮微生物。根据固氮微生物的固氮特性，可以将它们分为共生固氮微生物、自生固氮微生物和联合固氮微生物3类。关于生物固氮的认识，最初认为某些微生物能够和豆科植物共生形成根瘤，能够固氮，促进豆科植物的生长。直至1958年，Dobereine等从甘蔗根中分离得到固氮内生细菌，非豆科植物的内生固氮细菌才逐渐引起学者的关注[5]。自此以后，人们从水稻、玉米、小麦、高粱、甘蔗等非豆科植物中分离到了许多内生固氮菌。

3.1.3 铁载体作用

铁是生命体必需的一种营养元素，生命体的呼吸作用、光合作用、氮的固定和核酸的生物合成等众多生物代谢过程均离不开铁元素。铁存在着还原型Fe2+和氧化型Fe3+2种能够可逆变化的化合态，在自然界中，铁主要以三价的氧化物或氢氧化物的固态形式存在，形态稳定，不易电离，故生物利用效率较低，因此铁成为植物生长的一个制约条件。某些微生物能够合成并分泌一种用于摄取铁元素的低分子量化合物，称为铁载体。大量研究证明，许多植物都可以吸收细菌的铁载体，对于植物吸收利用铁离子至关重要，这种方式是此类细菌促进植物生长的一个方面，另一方面则是通过和病原菌争夺有限的铁营养，从而抑制病原微生物生长繁殖，起到生物防治作用[21]。

3.1.4 植物激素促生作用

植物内生菌能够直接合成或者促进宿主合成植物激素来调节植物生长，例如，生长素、细胞分裂素及赤霉素等。生长素即吲哚乙酸(简称IAA)对植物的促进作用主要是促进细胞的生长，特别是细胞的伸长。吕泽勋等[22]从水稻组织中分离出1株产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)，可以分泌生长素，对植物的生长发育有着显著的促进作用。细胞分裂素(cytokinin，CTK)是一类促进胞质分裂的物质，促进多种组织的分化和生长，是调节植物细胞生长和发育的植物激素，与植物生长素协同作用，共同影响植物生长。

3.1.5 抗逆作用

拮抗作用是指一种微生物抑制或杀死其余微生物的现象。根据作用机制的不同，拮抗作用又分为抗生、竞争和重寄生。生活在一起的2种微生物，如果其中一种微生物所产生的物质对另一种微生物有毒害作用，称为抗生。竞争是指同一微小生物环境中的2种或多种微生物之间争夺有限空间、营养和氧气等现象。植物病原菌被其他生物寄生的现象叫重寄生作用。植物修复(Phytoremediation)指的是利用植物超量富集重金属，然后收割植物处理，达到修复环境的目的。研究表明，植物内生细菌具有提高植物重金属抗性、增加其吸收重金属的潜力[23]，增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等作用。内生菌主要通过产生抗生素类物质、水解酶、植物生长调节剂、生物碱，并且与病原菌竞争营养物质和生态位，诱导植物产生抗性等方面增强宿主植物抗逆性和抗病虫害等作用。

3.2 对宿主植物的毒性作用或抑制作用

内生菌在侵染宿主初期或者在长期的共存中，由于外界环境的改变以及非寄主生物的入侵会产生有毒物质或溶解酶。这种毒性物质和溶解酶一般是非专一性的，会对宿主植物细胞组成、植物的生理功能以及对其敏感的非寄主生物造成毒害损伤或抑制作用，从而促进其生长或是获取有利的生长空间和营养物质[24]。

3.3 促进宿主植物次生代谢产物的产生

自Stierle等[24]首次从短叶红豆杉中分离得到1株能合成抗癌物质紫杉醇的紫杉霉属内生菌，表明有的植物内生菌能生成与宿主植物相同或相似的次生代谢产物，随后国内掀起了一股从内生菌中筛选与宿主植物相同活性成分的热潮，陆续从长春花、鸢尾、南方红豆杉等植物中分离得到了能分泌长春花碱、鸢尾碱、紫杉烷类化合物的菌株[25]。近年来已从植物内生菌中分离出生物碱类、萜类、甾体、有机酸、肽类、酮类和醌类等活性产物[25]。这些活性产物的产生可能是由于内生菌和宿主植物在基因层面的变化产生了信息传导通路，导致其与宿主产生相同或相似的次生代谢产物；也可能是由于内生菌参与了宿主植物体内的生物合成代谢造成，如内生菌在次生代谢产物的合成途径中协同或催化关键酶类或蛋白的合成[24]。

4 展望

我国地大物博、得天独厚的地域孕育了十分丰富的植物资源，开发植物内生菌具有广阔的前景。植物内生菌种类丰富，加之特殊的生存环境，使其成为一类应用前景广阔的资源微生物。然而与许多内生菌研究较多的国家相比，我国在植物内生菌方面的研究是比较落后的。虽然近些年在植物内生菌的入侵机理、系统学、生态学、资源开发方面展开了一系列的研究，但是仍有许多问题需要进一步探讨，如植物内生菌是许多菌构成的微生物群体，而且大多数植物内生菌仍然未被发现，植物内生菌的起源分子机理不清楚，植物内生菌的作用机理不清楚以及植物内生菌作为生防因子无法实际应用，不同生长时期需要怎样的群落以及何时对植物作用都不清楚等。未来的研究应重视植物内生菌的起源和植物内生菌的作用机理，将传统培养和非传统培养的方式结合起来，动态追踪植物内生菌的动态，以便研究植物内生菌的起源及其作用机理。随着植物内生菌研究的深入及其在各个领域的应用，必将给人类带来更多的利益，具有广阔的开发应用前景。

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