外泌体与胰腺癌化疗耐药的研究进展

金玲玲 王晓林 曹仕琼

华中科技大学同济医学院附属梨园医院消化内科（武汉 430077）

近年来，胰腺癌的发病率在全球范围内呈逐渐上升的趋势，根据美国癌症协会统计，胰腺癌位列癌症相关死亡的第4位［1］。胰腺癌的早期诊断十分困难，临床症状出现时往往已经到了晚期，患者的5年生存率仅为5%～10%，中位生存期为诊断后5～6个月［2］。近年来，外泌体作为肿瘤学目前研究的热点受到广泛关注，大量的文献显示，外泌体与胰腺癌的肿瘤组织的细胞增生、血管形成和免疫耐受有一定相关性，并可通过释放促耐药因子，如mRNA、miRNA等增加肿瘤细胞的化疗抵抗能力。

1 外泌体与肿瘤微环境

外泌体是一种直径为40～100 nm的具有脂质双分子层膜结构的膜性小囊泡，携带有蛋白、脂质和核酸等内容物，参与了如免疫应答、抗原提呈、细胞间通讯以及蛋白质和RNA转运等多种生理过程，是一种重要的细胞间物质和信息交流工具。外泌体可由机体中的多种细胞分泌，并广泛分布于唾液、血浆和乳汁等体液中［1⁃2］。肿瘤细胞源性外泌体（TDEs）携带多种由致癌病毒衍生的功能分子，包括各种致病miRNA、mRNA、DNA片段和蛋白质，如能够诱导恶性转化和癌变的Dicer蛋白等。TDEs可以通过参与调节血管生成、免疫反应及成纤维化等一系列生理活动来催化肿瘤微环境生态［3］。

外泌体与肿瘤的发生密切相关，研究［4］表明，正常人血液内大约含有2×1015个外泌体，而肿瘤患者的血液中则多达4×1015个。异常的细胞及病变器官则会产生更多的外泌体，其异质性也会随着肿瘤的演变而增加。在卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌患者的外周循环中可发现外泌体的浓度明显升高［5］。MELO等［6］在胰腺癌患者血清和患癌小鼠体内成功分离出了含GPC1的外泌体，其与健康对照组相比含量有明显差异。根据外泌体的GPC1水平，可以很好地将胰腺癌患者与慢性胰腺炎患者及健康人相区分，而且其灵敏度及特异性均可达到100%。同时有研究表明，在实验和临床已证实的胰腺癌中，miR⁃21和miR⁃203均呈现高表达水平，因此这些miRs可以为胰腺癌治疗提供新的方向［7］。

外泌体在肿瘤的转移中也发挥着重要的作用，有关乳腺癌的实验研究发现，富含miR⁃200的外泌体可以促进乳腺癌的肺部转移，通过改变基因表达使远处组织细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞的定植［8］。对胰腺癌细胞的研究［9］也发现，其释放的外泌体能够在肝中形成有利于肿瘤生长的预转移微环境（premetastatic niche），从而促进胰腺癌的肝转移。此外，还有研究显示来源于胰腺癌的富含CD44v6的外泌体，与胰腺癌淋巴结及肺组织的早期转移相关［10］。

2 外泌体与肿瘤的耐药机制

2.1 耐药细胞与敏感细胞之间的信号传递肿瘤的耐药包括天然耐药和获得性耐药，除了肿瘤细胞本身的遗传变化可导致药物外排增加或抗凋亡能力增强外，肿瘤微环境的保护作用也可引起肿瘤细胞的耐药。耐药肿瘤细胞源性外泌体可以在细胞外环境中通过释放mRNAs，miRNAs和蛋白质将耐药性传递给药物敏感的细胞［11］。SOUSA等［12］已证实外泌体与耐药的发展密切相关，耐药肿瘤细胞来源的外泌体可以通过药物外排泵和miRNAs转移传递抗性表型给药物敏感细胞。QU等［13］也发现，舒尼替尼耐药细胞的外泌体中嵌入的lncRNA可以将其耐药表型传递给RCC受体细胞。一项乳腺癌的耐药性研究表明，耐药肿瘤细胞高度表达GSTP1，同时从耐药细胞中分离出来的外泌体中发现GSTP1的含量也有所增高，外泌体通过将耐药肿瘤细胞的GSTP1转移给敏感细胞可以增强后者对阿霉素的耐药性。将阿霉素敏感细胞暴露在由阿霉素耐药细胞产生的含GSTP1的外泌体条件下，可以使其获得耐药表型，由此可以推断，耐药细胞的外泌体参与了GSTP1在乳腺癌耐药细胞与敏感细胞之间的转变［14］。另有研究［15］表明，耐药癌细胞与敏感癌细胞之间可以通过外泌体实现P糖蛋白（P⁃gp）细胞间转移。UCH⁃L1是泛素羧基末端水解酶的一员（UCH）家族中的一种，在许多肿瘤中表达，并与肿瘤细胞的分化、转移和多药耐药相关。UCH⁃L1通过MAPK/ERK信号通路上调P⁃gp蛋白的表达水平增强乳腺癌多药耐药［16］。一项肺癌化疗耐药的相关研究［17-18］表明，对顺铂耐药的肺癌细胞来源的外泌体通过低表达miR⁃100⁃5p使受体细胞产生对顺铂的耐药性，而细胞中miR100⁃5p低表达可能导致mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）的高表达，从而导致癌细胞对顺铂耐药。

2.2 基质细胞与肿瘤细胞之间的信号传递除了肿瘤细胞之间的相互影响之外，一些基质细胞也可以对肿瘤细胞的耐药发挥作用，如：骨髓基质细胞分泌的外泌体诱导骨髓瘤细胞产生硼替佐米抵抗，从而促进骨髓瘤细胞的生长［19］。肝癌细胞来源的外泌体通过增加肿瘤微环境中HGF的水平和在体外激活PI3K/Akt通路来诱导索拉菲尼耐药，不同浸润性肝癌细胞来源的外泌体能够调节肝癌索拉非尼的敏感性，部分逆转索拉非尼诱导的癌细胞凋亡，高度侵袭性肝癌细胞源性的外泌体具有更强的诱导索拉菲尼耐药的能力［20］。癌细胞通过STAT1依赖抗病毒途径和Notch3信号通路的活化来传递成纤维细胞来源的外泌体，也可以让乳腺癌细胞形成耐药和放疗抵抗［21］。有研究［22］表明，来源于M2型巨细胞的外泌体相比于未活化的巨噬细胞更多的表达miR⁃21，而外泌体将miR⁃21由M2型巨细胞传递给胃癌细胞将会导致这些胃癌细胞对顺铂产生耐药，外泌体所含miR⁃21通过下调PTEN基因导致PI3K/Akt信号通路激活来促进顺铂耐药。此外，来源于M2型巨细胞的外泌体通过调控抗凋亡蛋白Bcl⁃2诱导细胞凋亡来保护胃癌细胞。

3 外泌体与胰腺癌化疗耐药

3.1 外泌体与胰腺癌细胞增殖胰腺星状细胞（PSCs）是胰腺间质中的重要组成成分，正常情况下处于休眠状态，主要分布于胰腺血管周围［23］。在胰腺癌中，PSCs活化后会产生富含miR21的外泌体，其可以促进肿瘤上皮细胞向间质细胞转化，增强肿瘤细胞的增殖能力，且促进细胞间质增生。而miR21的表达与胰腺癌患者生存率密切相关。外泌体中miR⁃21的水平越高，患者预后越差［24］。同时，PSCs还会分泌大量炎症因子如 IL⁃6、IL⁃8、IL⁃15等，通过自分泌、旁分泌的途径激活其他处于休眠状态的PSCs，释放更多肿瘤相关的外泌体，加速胰腺癌的进展。

3.2 外泌体与胰腺癌免疫耐受形成肿瘤细胞分泌的外泌体与巨噬细胞分化密切相关。免疫组化试验证实，在胰腺癌侵袭的边界，多为M2型巨噬细胞，并且其数量与周围淋巴结转移程度及早期远处转移呈正相关，而与患者预后呈负相关［25］。但近期也有实验证据表明，中性粒细胞与巨噬细胞一样，可以转变为促进肿瘤生长的细胞表型，参与肿瘤的增生、血管生成、侵袭及免疫抑制等。中性粒细胞的水平与患者预后息息相关，外周血中性粒细胞/淋巴细胞比值越高，患者预后越差［26］。外泌体能促进固有免疫细胞产生TGF⁃β，这可能在肿瘤免疫耐受的维持中起重要作用。在肿瘤微环境，CD4+调节性T细胞会分泌外泌体，抑制Thl反应并参与免疫耐受反应［27］。同时，肿瘤细胞来源的外泌体有免疫抑制作用，主要通过直接抑制免疫细胞功能或调节相关细胞因子表达分泌等途径，促进肿瘤的免疫逃逸，进而在肿瘤的发生、进展中发挥关键作用。胰腺癌外泌体中的miR203可通过抑制Toll样受体4（TLR4）、肿瘤坏死因子⁃α（TNF⁃α）和白细胞介素12（IL12）表达，使树突细胞的免疫激活功能出现异常，从而导致肿瘤的免疫逃逸［28］。

3.3 外泌体与胰腺癌的化疗耐药形成外泌体是一种重要的细胞间物质和信息交流工具，它通过在细胞间传递基因和蛋白信号调节肿瘤微环境，从而介导肿瘤细胞间的血管形成、分化、凋亡和转移。越来越多的实验已经证明了外泌体及其所含的miRNAs，蛋白质，snRNAs等都与肿瘤耐药的发生密切相关［29］。吉西他滨作为胰腺癌的一线化疗药物，其疗效并不是很理想，首先癌组织丰富的基质和低血管化使得药物的运输受阻，降低药物的效率；其次肿瘤组织对吉西他滨耐药也是患者生存率不高的重要原因［30］。

癌相关成纤维细胞（CAFs）具有天然的化学耐药作用，并在肿瘤细胞的耐药发生中发挥了重要作用。对胰腺导管腺癌来说，成纤维细胞是其主要组成部分，成纤维细胞可抑制或促进肿瘤的发展［31］。暴露于吉西他滨中的成纤维细胞的外泌体分泌大幅度增多，具体的就是外泌体中的Snail（SNAI1）和Snail靶点，miRNA⁃146a增多。而在体外培养时，减少外泌体的分泌可以减少Snail表达，同时能减少耐药癌细胞存活。同时该实验证实了被吉西他滨处理的肿瘤相关成纤维细胞大量释放含有促耐药因子的外泌体，如mRNA、miRNA等，给上皮细胞受体。在吉西他滨治疗中随着肿瘤相关成纤维细胞上游转录因子Snail上调，其释放的外泌体中miR⁃146a的水平高度增加，胰腺导管腺癌上皮细胞的CAFs释放的外泌体及Snail mRNA水平升高，导致肿瘤细胞增值和耐药性的增加。同时，减少外泌体的释放可以抑制CAFs促进耐药的能力［32］。

外泌体可以通过旁分泌作用从基因水平调节肿瘤细胞耐药。正因如此，可能会有一组miRNAs通过改变细胞的生长和诱导抗凋亡程序来转移耐药表型给敏感细胞［30］。miR⁃155与肿瘤细胞的耐药相关性已被临床标本和体内实验证实。miR⁃155在吉西他滨耐药的胰腺导管癌细胞和致吉西他滨耐药的外泌体中过度表达，接受吉西他滨治疗的患者，如果其导管癌上皮细胞出现高miR⁃155表达则预后极差。高表达的miR⁃155通过抗凋亡活动造成吉西他滨耐药，miR⁃155的表达增加进一步促进含有miR⁃155的外泌体释放，从而造成肿瘤细胞吉西他滨耐药形成，阻断外泌体的运输可以减少miR⁃155造成的吉西他滨耐药［33⁃34］，有研究［35］表明，长时间暴露于吉西他滨可以增加胰腺导管癌细胞miR⁃155的表达，miR⁃155的表达水平与促进吉西他滨耐药性的外泌体的释放呈正相关，增加miR⁃155表达同时阻断外泌体释放并不导致吉西他滨耐药。

另外，外泌体中的某些活性蛋白也可以导致肿瘤的化疗耐药。新的研究［36］发现，在获得性耐药的胰腺癌细胞分泌的外泌体中，超氧化物歧化酶2（SOD2）和CAT（一种活性氧解毒酶）的表达增加而DCK（吉西他滨代谢酶）的表达减少。同时，该研究表明，miR155功能抑制或者DCK表达恢复可以使胰腺癌细胞外泌体介导的获得性耐药得到解除。因此，条件培养下的吉西他滨处理的胰腺癌细胞释放的外泌体与胰腺癌细胞的获得性耐药密切相关。

4 小结

外泌体的内容物可以从一个细胞传递到另一个细胞，它们通过与包括肿瘤细胞在内的靶细胞融合或相互作用介导特定的细胞与细胞之间相互作用，激活细胞中的信号通路。外泌体在肿瘤细胞的增殖、转移、耐药性及诊断与治疗等多个方面均发挥了重要作用，其在肿瘤耐药中的作用已经得到验证。针对外泌体在胰腺癌化疗耐药中的研究，有助于早日解决“胰腺癌治疗”的难题，为胰腺癌新的治疗方式提供可能。目前针对胰腺癌耐药的研究，主要集中在外泌体miRNA，InRNA和蛋白等的表达对细胞耐药表型的影响，从而影响胰腺癌的化疗敏感性，但其中的很多通路与机制仍不十分确定，尚未形成比较明确的耐药研究结果。未来，随着对外泌体研究的不断深入，这些问题会逐步解决，为胰腺癌患者的化疗治疗带来新的曙光。

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