烟草盐胁迫与耐盐相关基因的研究进展

金伊楠，许自成，张环纬，王发展，陈思昂，熊亚南，魏烁果

河南农业大学烟草学院，河南郑州农业路63号 450002

盐胁迫是全球农业生产力的主要制约因素，土壤盐碱化严重影响包括烟草在内的作物品质[1]。盐碱土壤在我国分布十分广泛，据不完全统计，现阶段我国盐碱地总面积约36000000hm2，占全国可利用土地面积的4.88%。耕地中盐碱化面积达到920.90000hm2，占全国耕地面积 6.62%[2]。盐碱土的物理和化学性质较差，表现为孔隙度小、易板结、透性差，土壤养分利用率下降。烟草作为重要的模式植物和经济作物，被越来越多地用于耐盐胁迫的研究。本文对烟草耐盐胁迫的作用机制及耐盐相关基因表达的研究进展进行了综述，以期为烟草的耐盐胁迫研究及种植布局调整提供参考依据。

1 烟草耐盐胁迫的作用机制

盐胁迫是指植株在高盐度土壤中因高渗透势的影响而不能正常生长[3]。烟草盐胁迫可分为两个方面，一是盐胁迫造成的离子毒害，如破坏质膜结构、阻碍必须矿质元素吸收等[4]；二是盐胁迫引发的次生胁迫效应，如氧化胁迫、干旱胁迫等[5]。盐胁迫抑制植物生长发育，严重者导致植株死亡。烟草在长期的自然选择进化过程中形成了抵御盐胁迫的方式，主要通过离子平衡、渗透调节和清除活性氧来减轻盐胁迫造成的伤害。

1.1 离子平衡机制

离子平衡是指当植物受到盐胁迫时，细胞中的离子平衡被打破，大量的Na+可通过K+通道进入细胞。为抵抗盐胁迫、维持细胞内离子的平衡状态，植物会通过激活膜通道蛋白、转运蛋白来调节离子运输[6]。常见的转运蛋白有Na+/H+逆向转运蛋白、ABC转运蛋白、钾离子转运蛋白等。其中Na+/H+逆向转运蛋白可利用液泡膜上的H+泵将H+运输到膜外[7]，促进Na+进行跨膜转运；ABC转运蛋白借助水解ATP释放的能量完成跨膜运输；钾离子转运蛋白通过增加H+泵的活性来驱动对钾离子的转运，加大对K+的吸收。植物通过转运蛋白来调节离子运输，既控制了细胞渗透压在正常范围之内，使水分正常进入细胞；又控制细胞质中盐离子的浓度，防止浓度过高破坏细胞膜[8]，从而实现离子平衡。

1.2 渗透调节机制

植物细胞受到盐胁迫时大量失水，为了缓解这一状况，植物通过主动积累各种有机或无机物质来提高细胞液的浓度，降低渗透势，维持细胞吸水或保水能力，从而达到缓解盐胁迫的目的。烟草的渗透调节主要分为无机渗透调节与有机渗透调节，无机渗透调节是指细胞内Na+、K+、Ca2+、Cl-等离子大量积累，使细胞内的渗透势升高，从而完成渗透调节[9]。有机渗透调节是指植物受到盐胁迫后自身合成并积累一部分可溶性有机物质，例如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱、甘油、甘露醇等，来降低盐胁迫对细胞的损伤。

1.3 清除活性氧机制

盐胁迫破坏了植物体内活性氧的平衡，使植物细胞内积累大量的活性氧，例如单线态（1O2）、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2）等[10]。活性氧使细胞膜脂过氧化，破坏细胞膜的完整性。植物通过清除活性氧的抗氧化系统来缓解盐胁迫，主要包括酶促清除系统和非酶促清除系统。酶促清除系统中的抗氧化酶主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶[11]。非酶促清除系统包括谷胱甘肽、多元醇、类黄酮和维生素C（抗坏血酸）等抗氧化剂[12]。

2 烟草耐盐胁迫的相关基因

2.1 离子转运相关基因

2.1.1 编码Na+/H+逆向转运蛋白基因

Na+/H+逆向转运蛋白的功能是将Na+排出细胞，或运送到液泡中从而保持细胞质处于低Na+水平，高等植物中的Na+/H+逆向转运蛋白主要定位于液泡膜和细胞质膜，分别称为液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白（V型）和质膜 Na+/H+逆向转运蛋白（P型）[13]。

NHX1可编码液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白[14]。1999年Gaxiola首次在拟南芥中克隆了AtNHX1基因[15]，转入番茄后发现转化株的Na+/H+逆向转运蛋白在液泡膜中大量积累，植株的耐盐能力得到提高[16]。CHEN等[17]将盐角草SeNHX1基因导入烟草，转基因烟草的根长增加和K+/Na+比值提高，耐盐性增强。陈鑫等[18]将碱蓬SsNHX1基因转入烟草，经NaCl处理后转基因烟株具有较高的K+/Na+比值、抗氧化酶活性、叶绿素含量和发芽率，表明其抗旱性和耐盐性明显增强。

细胞质中的Na+外流还可以通过质膜Na+/H+逆向转运蛋白完成，SOS1是编码质膜Na+/H+逆向转运蛋白的基因，可将细胞质中的Na+维持在无毒水平。ZHOU等[19]利用小麦TaSOS1-974基因转入烟草，转基因烟草植株的生长优于对照，盐胁迫处理后转基因烟草根中的Na+外流和K+流入速率增大，表明TaSOS1-974可能具有保护质膜免受盐胁迫产生氧化损伤的作用。目前大多数学者侧重于NHX1基因的研究，而对SOS1基因在烟草中的作用研究较少。

2.1.2 编码K+、Na+转运蛋白基因

高亲和钾离子转运体蛋白（HAK）可选择性地从环境中吸收K+，平衡细胞内的Na+/K+比率，防止Na+含量过高对细胞的毒害[20]。秦利军等[21]对烟草NtHAK1基因进行研究，表明NaCl处理后转基因烟株的抗氧化酶活性增加，与K+吸收相关的通道蛋白基因的表达上调，例如TORK1基因。钠离子转运蛋白（SKC）可专一运输Na+，不参与K+等其他阳离子的运输，在抵抗非生物胁迫中发挥着重要作用。姚新转等[22]将高粱SbSKC1基因导入烟草，结果显示NaCl胁迫处理后转基因烟株的存活率和根长显著高于对照，SOD、CAT和POD酶活性均有提高，转基因烟株的耐盐性得到加强。

2.2 渗透调节相关基因

2.2.1 编码甜菜碱合成途径的关键酶基因

甜菜碱是植物体内的一种水溶性生物碱，作为一种渗透调节物具有较强亲和力。甜菜碱在细胞遭遇渗透胁迫后大量积累，以维持细胞渗透压。一般植物中甜菜碱的主要合成途径是以胆碱为底物，经胆碱单加氧酶(CMO)的催化生成甜菜碱醛，再经甜菜碱醛脱氢酶(BADH)的催化最终生成甜菜碱。而烟草没有与甜菜碱合成相关的酶，不能合成甜菜碱。现阶段对甜菜碱的研究较多，并且针对CMO、BADH基因的研究较深入。

WU等[23]将盐生植物海蓬子CMO基因转入烟草，转基因烟株可在盐胁迫下正常生长，叶绿素含量和甜菜碱积累明显高于对照，耐盐性得到提高。LUO等[24]将水稻OsCMO基因导入烟草，发现转基因烟株甜菜碱含量增加，对盐胁迫的耐受性提高。

Rathinasabapathi等早在1994年将菠菜及甜菜的BADH基因导入烟草，转基因植株在NaCl胁迫下可正常生长[25]。有研究表明[26]，在烟草中表达矮沙冬青AnBADH基因，转基因烟苗在NaCl胁迫下可正常生长，盐胁迫处理后转基因植株的甜菜碱含量升高，可溶性糖含量、游离脯氨酸含量显著增加，转AnBADH基因烟株的耐盐性明显增强。

2.2.2 编码脯氨酸合成途径的关键酶基因

脯氨酸是植物细胞应对非生物胁迫产生的一种低分子量、高水溶性的小分子有机化合物。在盐胁迫条件下，植物组织积累脯氨酸，从而减轻过量氨对机体的毒害作用、清除自由基以保护质膜的完整性、调节渗透压来防止质膜透性的变化。

脯氨酸合成途径之一是以谷氨酸（Glu）为底物，经吡咯啉 -5- 羧酸合成酶（P5CS）和吡咯啉 -5- 羧酸还原酶（P5CR）等酶的催化最终生成脯氨酸[27]（图1），该途径主要在细胞质和叶绿体中进行[28]。早在1995年，Kishor等就将P5CS编码基因导入烟草，转基因烟株中脯氨酸含量明显增加，其耐盐性远高于对照组[29]。

脯氨酸的合成底物谷氨酸主要来源于谷氨酰胺合成酶—谷氨酸合成酶（GS-GOGAT），植物谷氨酰胺合成酶有许多同工酶，可分为胞液型谷氨酰胺合成酶（GS1）和质体型谷氨酰胺合成酶（GS2）[30]。贾喜婷等[31]研究认为过表达TaGS1/TaGS2可增加烟草在盐胁迫后的脯氨酸含量，提高氮素利用率和耐盐能力。Luca等[32]研究表明过表达柑橘CsGSTs基因的烟草植株表现出对盐胁迫耐受性。

图1 植物脯氨酸合成途径Fig.1 Synthesis pathway of proline in plants

2.2.3 编码海藻糖合成途径的关键酶基因

可溶性糖，如海藻糖具有渗透调节作用，海藻糖-6-磷酸合成酶（TPS）是参与海藻糖合成过程中的关键酶。郭蓓等[33]将拟南芥AtTPS基因导入烟草，发现转基因烟草植株的海藻糖含量增加，盐胁迫耐受性得到增强。

2.3 抗氧化性相关的酶基因

2.3.1 超氧化物歧化酶

烟草遭受逆境胁迫时，烟株体内聚集大量的活性氧（ROS）。近年来，研究人员采用基因工程的手段表达ROS清除因子来提高烟草的抗盐性。超氧化物歧化酶（SOD）有多种类型，例如CuZnSOD、Fe-SOD、Mn-SOD和Ni-SOD等，在烟草中研究较多的是CuZnSOD。

CuZnSOD是定位于细胞质和叶绿体中的超氧化物歧化酶，Negi等[34]将从耐盐花生细胞系中分离的AhCuZnSOD基因导入烟草，转基因烟株的AhCuZnSOD基因在干旱、高盐、寒冷和氧化胁迫等多种非生物胁迫下转录上调，使SOD酶活性增加，从而改善了非生物胁迫下的氧化损伤。JING等[35]将秋茄中编码CuZnSOD的KcCSD基因导入烟草，转基因烟草SOD酶活性增强，通过排除根中的Na+提高了烟株的耐盐性。

2.3.2 抗坏血酸过氧化物酶

抗坏血酸过氧化物酶（APX）是一种具有抗氧化作用的物质，可有效清除细胞内的ROS，主要通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环系统（AsA-GSH）完成，该系统通过抗坏血酸过氧化物酶和脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）等的作用维持抗坏血酸和谷胱甘肽氧化还原状态的平衡[36]。

研究表明[37]，将番茄LetAPX基因转入烟草，转基因烟株的APX酶活性明显提高，烟草种子发芽率增加，对盐胁迫的耐受性增强。LIU等[38]将麻疯树JctAPX基因转入烟草，转基因植株耐盐性增加，叶绿素含量和APX酶活性增强。Singh等[39]发现转海蓬子SbpAPX基因烟草的耐盐性和对干旱胁迫的耐受性得到提高。

DHAR在盐胁迫时能清除细胞中过量的活性氧，增强植株对非生物胁迫的抗性。吴茜等[40]将拟南芥DHAR基因导入烟草，转基因植株表现较强的耐盐能力，其地上部分生物量、叶绿素含量和光合速率都显著高于对照。

2.3.3 过氧化物氧化还原酶

过氧化物氧化还原酶（Prxs）是存在于生物体内的一类抗氧化酶系[41]。2-Cys Prx具有清除叶绿体内ROS的能力，将该基因转入烟草中可提高SOD酶活性，抑制APX酶活性，在高盐环境下增强光合电子传递链的稳定性，降低PSII的光抑制程度[42]。

2.4 信号传导与表达调控相关基因

2.4.1 ERF类转录因子

转录因子在植物非生物胁迫中起至关重要的作用，主要参与信号传导。乙烯反应因子（ERF）是一类数量较多的植物特异性转录因子家族。

研究表明，将ERF类转录因子W6基因导入烟草，盐胁迫下的转化烟株SOD 酶活性和叶绿素含量较对照增加[43]。YANG等[44]将麻疯树中JcERF1基因导入烟草，能够增强烟草的耐盐性，并发现JcERF1蛋白的靶向在细胞核。WANG等[45]在麻疯树中发现JcERF2基因，转入烟草发现过表达JcERF2基因的烟株游离脯氨酸含量和可溶性糖的含量增加，H2O2含量降低，这些结果暗示转JcERF2基因的烟草耐盐性提高。张朝等[46]将ERF类转录因子TaW基因导入烟草，发现叶片的叶绿素含量增加，且生长情况优于对照，TaW基因的过表达提高了烟草的耐盐性。WU等[47]发现转枸杞LchERF基因烟草的耐盐性提高。YAO等[48]将杨树ERF76基因导入烟草中，盐胁迫下转基因烟草的种子发芽率、根长、鲜重、SOD、POD酶活性和脯氨酸含量增加，烟草耐盐性得到提高。

2.4.2 DREB类转录因子

脱水响应元件结合蛋白（DREB）类转录因子属于AP2 / ERF基因家族，广泛参与植物应激反应途径，其抵御非生物胁迫的功能已在多种植物中得到鉴定[49]。

李彦帮等[50]对转二色补血草LbDREB基因的烟草进行研究，表明转基因烟株SOD酶活性和K+/Na+比值提高，LbDREB基因调节过氧化物酶基因（POD）和脂质转移蛋白基因（LTP）的表达，转基因烟草的耐盐性提高。WEN等[51]从柳枝稷中克隆DREB基因转入烟草，鉴定出4种冷诱导型PvDREB1，其中PvDREB1C是对冷胁迫响应最快的基因型。在盐胁迫下，转PvDREB1C基因的植株叶片K+/Na+比值和Ca2+含量增加，耐盐性提高，推测该基因可能与细胞渗透势增加有关。赵清等[52]研究表明，转拟南芥DREB2A基因烟草对盐胁迫的耐受性提高。ZHANG等[53]将多汁碱蓬SsDREB基因导入烟草，过表达SsDREB的烟株对盐和干旱胁迫的耐受性得到增强。

2.4.3 WRKY类转录因子

WRKY类转录因子是植物当中一类比较大的转录因子家族。这类转录因子的蛋白包括一个或两个保守的WRKYGQK 序列（由此而命名为 WRKY）。WRKY类转录因子是在植物中发现的N-端含有高度保守氨基酸序列的新型转录调控因子，可与TGAC序列发生特异性作用，调节启动子中含有W-box元件的调节基因和功能基因的表达，可在非生物胁迫中发挥重要的作用[54]。

LI等[55]发现在烟草中过表达番茄SpWRKY1可提高对烟草黑胫病的抗性，转基因烟草植株对盐和干旱胁迫的耐受性也得到增加。LIU等[56]从棉花中克隆获得GhWRKY25，发现转化GhWRKY25基因降低了转基因烟株的耐旱性，但可增强烟株的耐盐性。WANG等[57]从小麦中分离出TaWRKY44基因，转TaWRKY44基因烟草植株具有较高的SOD、CAT和POD酶活性，从而增强了耐盐性。

2.4.4 锌指蛋白类转录因子

锌指蛋白是一类数量较大的转录因子家族，主要通过与Zn2+结合维持一种可自我形成“指状”结构的结构域，参与调控基因的表达[58]。锌指蛋白类转录因子可分为C2H2、C2C2、C2HC等，其中C2H2型是真核生物基因组中数量最多的锌指蛋白[59]。

于瑞等[60]对过表达秋茄KcZFP的转基因烟草进行研究，发现该基因属于C2H2型，对光合系统有一定的保护作用，转基因烟株的脯氨酸含量高于对照，提高了烟草的耐盐性。ZPT2是具有两个锌指结构域的C2H2型锌指蛋白转录因子，Dechun等将枸橘PtrZPT2-1导入烟草中，转基因烟株中渗透调节溶质增加和H2O2减少，从而增强了烟株的抗寒、抗旱和耐盐性[61]。

SAP是涉及胁迫应答与调控的锌指蛋白，水稻OsSAP1是植物中第一个被报道的AN1/A20 型锌指蛋白，该基因可提高转基因烟草对低温、干旱和盐胁迫的耐受能力[62]。丁林云等向烟草中转入棉花GhSAP1基因，转基因烟草的叶绿素和可溶性总糖含量增加，SOD酶活性提高，K+/Na+比值处于平衡水平，从而使耐盐性增强[63]。

2.4.5 钙依赖蛋白激酶合成相关基因

钙依赖蛋白激酶（CDPKs）在钙信号传递到下游效应中发挥了重要作用。康乐等[64]发现，盐胁迫后普通烟草NtCDPK15基因在茎中表达量显著上调；在叶中可实现诱导表达；在根中的表达则不受影响。Vivek等[65]从生姜产生的应激cDNA中分离到ZoCDPK1基因，发现ZoCDPK1基因可增加烟草的耐盐性，ZoCDPK1在烟草中的表达水平上调与胁迫相关的RD21A和ERD1基因有关。总的看来，目前关于烟草中CDPK蛋白基因的报道较少。

2.4.6 油菜素甾醇合成的关键酶基因

油菜素甾醇（BRs）是一种新型的植物生长调节物质。CPD基因编码甾醇类23a羟化酶，是油菜素甾醇合成途径中的关键酶。陈永富等[66]将胡杨PeCPD基因导入烟草，转基因烟株的鲜重是对照的一倍多，且叶绿素含量、SOD和POD酶活性提高，研究结果暗示PeCPD基因在提高烟草耐盐性中发挥着重要作用。CYP85A1基因编码催化BRs生物合成的关键酶[67]，过量表达菠菜SoCYP85A1基因可增强烟草的耐盐性[68]。

2.5 保护细胞免受胁迫伤害的相关功能蛋白基因

植物体内存在大量编码功能蛋白的基因，可对逆境胁迫产生不同的响应。高盐条件下，LEA蛋白能维持细胞结构的稳定性[69]。赵微等[70]从大麦中获得了编码LEA家族HVA蛋白的基因HVA1，将其转入烟草后发现，外源HVA1基因有助于烟草种子在盐胁迫下的萌发，增加耐盐性。

扩展蛋白是通过介导细胞壁扩张来调节植物生长发育和非生物胁迫耐受性的细胞壁蛋白。CHEN等[71]将小麦膨胀素基因TaEXPA2转入烟草中，发现转TaEXPA2的烟株对盐胁迫的耐受性提高，并且发芽率和存活率上升；过表达TaEXPA2基因提高了烟草的耐盐性，这可能与水分状态的改善、Na+/K+的动态平衡和抗氧化能力相关。

3 展望

盐胁迫已成为非生物胁迫中的重点研究领域，烟草作为重要的模式植物也得到了越来越多的关注。近年来，大部分对烟草盐胁迫的研究都是通过基因工程进行的，因此，以下问题值得进一步思考：

（1）现阶段基因工程已经成为烟草耐盐性研究的重要方法，大部分研究仅涉及将外源基因导入烟草并进行功能验证，尚未涉及基因敲除技术，以及抗盐胁迫突变体等方面的研究。

（2）关于烟草耐盐相关基因的研究，大多集中在其它植物耐盐基因在烟草中的应用研究，针对烟草自身耐盐基因的研究则相对较少。

（3）对转基因烟草耐盐性机制的研究还不够具体深入，尚未明确哪个反应过程对抵御盐胁迫是有帮助的。

（4）已有少量研究将双基因导入到烟草中，但基因间是否存在交互作作用，以及对转双基因植株的功能研究还不够深入。

（5）大部分关于烟草盐胁迫的研究都是将烟草作为一种媒介，而对改良烟草品质的应用研究较少，同时，有关烟草盐胁迫的研究尚未有效地服务于生产实践。因此，关于烟草耐盐胁迫的相关研究尚需进一步深入。