湖北省烟草赤星病长柄链格孢遗传多样性分析

杨涛，黎妍妍，郑露，黄俊斌，黄凯，郭利，周鹏，袁跃斌，彭五星，李锡宏

1 华中农业大学植物科技学院，湖北省作物病害监测和安全控制重点实验室，武汉430070；

2 湖北省中烟工业有限责任公司恩施卷烟厂，湖北 恩施 445000；

3 湖北省烟草科学研究院，武汉 430030；

4 湖北省烟草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；

5 湖北省烟草公司襄阳市公司，湖北 襄阳 441100；

6 湖北省烟草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；

7 湖北省烟草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500

烟草赤星病是危害全世界烟草生产最主要的真菌性病害之一，其病原菌属于半知菌类链格孢属[1]。我国于1916年首次在北京近郊发现该病，80年代以来，全国烟区有日益严重的趋势，尤以黑龙江省、吉林两省危害最重。1990年以后，该病在我国迅速发展成为烟草主要病害之一，对烟叶产量、产值有显著影响[2-5]，烟草赤星病发生严重时对烟叶产量的损失达到30%，而对产值损失率最高可以达到90%[6]，据统计，2002年烟草赤星病发生面积2万公顷，产量损失约2万公斤，产值损失达到1.8亿元[7]。目前国内已报道的引起烟草赤星病的链格孢种类有A.alternata、A. longipes、A. tenuissim、A. yaliinficiens和A. tabacicola，其 中A. alternata和A. longipes可引起云南[8]和贵州烟草赤星病[9]，A. tenuissima可引起重庆烟草赤星病[10]，河南省发现的烟草赤星病病原菌包含了已知的5个种[11]，而湖北省烟草赤星病菌由A. tenuissima、A. alternata、A. yaliinficiens和A.longipes4个种引起，其中长柄链格孢A. longipes是优势致病菌，不仅在湖北省各个烟区都有分布，且不同地方的菌株致病力存在差异[12]。

ISSR是Zietkiewicz在SSR基础上发展起来的一种分子标记技术[13]。该技术已广泛用于生物遗传连锁图谱的构建、基因定位、种质资源鉴定、分类、进化和遗传多样性分析等方面的研究[14-15]。王叶[16]采用ISSR技术对引起枣果病害的链格孢属病原真菌进行遗传多样性分析，结果表明在地理区域划分中濮阳地区和山东地区的菌株能够大致的分在独立的组，说明ISSR技术可以用做对链格孢病原菌的遗传多样性研究。胡中会对赤星病ISSR-PCR正交体系进行了优化[17]，并采用ISSR和RAPD两种分子标记方法对种群的遗传多样性与地理来源的关系进行了分析，结果显示菌株的遗传多样性和地理来源并无明显的相关性[18]。祖艳青[11]采用ISSR技术对河南省烟草赤星病 鉴 定 为A.alternata、A.longipes、A.tenuissima及A.yaliinficiens的4个种也进行了遗传多样性和地理来源的相关性分析，与胡中会研究得到的结果相似。

本研究拟通过ISSR分子标记的方法，以湖北省十堰、襄阳、恩施、宜昌等4个产烟区的优势致病种—长柄链格孢菌为研究对象，对其遗传多样性、遗传结构与分化以及种群间遗传变异进行了多方位的分析，以期为烟草赤星病的防治奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

采用单孢分离法，并经过形态学和分子鉴定从烟草赤星病病斑上获得了34株长柄链格孢菌株，菌株编号和信息见表1。

表1 供试菌株来源以及寄主信息Tab.1 Source of test isolate and host information

1.2 基因组DNA提取及检测

将供试菌株转入铺有灭菌玻璃纸的PDA培养基平板上培养，7 d后收集菌丝。采用Huang等[19]CTAB法提取菌株基因组DNA，用0.8%(m/V)的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性，用德国IMPLENP300核酸蛋白超微量紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，A260/A280在1.90以上，并将DNA用TE稀释至终浓度为 50 ng·μL-1，放入 -20℃冰箱保存。

1.3 引物的筛选及ISSR-PCR反应体系

所用ISSR引物参考Zietkiewicz[13]、王叶[16]的研究。用擎科生物科技有限公司合成的32条引物进行初步筛选，选取8条多态性好、谱带清晰、稳定可靠的引物(表2)用于对菌株的遗传关系研究。采用25 µL的体系进行扩增，10 µmol/L的上下游引物共2 µL，ddH2O 9.5 µL，20 ng/µL 的 DNA 模板 1µL，反应用的PCR Mix12.5 µL。扩增程序为94℃预变性5min；接着进行35个循环：94℃变性30 s，复性45 s，72℃延伸1.5 min；循环结束后72℃延伸10 min。

1.4 遗传多样性数据统计与分析

根据ISSR-PCR条带的有无，将统计结果构建0，1矩阵，并保存为Excel文件格式。利用POPGENE（version 3.2）软件计算以下参数。

反映基因多少和状况的遗传参数：多态性位点百分率P（Proportion of polymorphic loci），等位基因观测数Na（Observed number of alleles）和有效等位基因数 Ne（Effective number of alleles）。

反映基因多样性信息的遗传参数：Shannon 信息指数 I（Shannons information index）[20]，表型多样性指数[21]，Nei’s基因多样性指数H（Gene diversity within the species）[20]。

反映遗传分化程度的参数：总的遗传多样性Ht（Gene diversity），群体内的遗传多样性Hs（Gene diversity within population），群体间遗传多样性Dst（Gene diversity among population），Dst = Ht﹣Hs， 遗 传分化系数Gst（Coefficient of gene differentiation among population within species），Gst = Dst/Ht。居群每代迁移数Nm（number of migrants per generation）。

反映基因差异的参数：不同群体间的遗传相似性I（Genetic identity）和遗传距离D（Genetic distance）。对遗传距离进行聚类分析并通过Tree plot模块生成聚类图。

采用NTSYSpc-2.10软件SHAN程序中的UPGMA（Unweighted pair-group mean average，非加权算术平均聚类），按照遗传相似性对群体进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 ISSR-PCR引物扩增多态性

用筛选得到的8条重复性好、多态性丰富的引物扩增34个菌株，部分引物的筛选结果如下图所示（图1），引物的扩增结果如图（图2）；由表2统计可以看出，8条ISSR引物扩增34个菌株共扩增出116个位点，其中多态性位点99个，多态位点百分率（P）为85.34%。引物UBC810的扩增位点最多，为18个；引物UBC811的扩增位点最少，为12个。

图1 ISSR引物UBC810、UBC826对部分供试长柄链格孢菌株的电泳图Fig.1 Electropherograms of ISSR primers UBC810, UBC826 on some tested strains of A. longipes

图2 ISSR引物UBC811扩增菌株的电泳图Fig.2 Electropherograms of ISSR primers UBC811 on some tested strains of A.longipes

表2 ISSR引物的多态性Tab.2 Polymorphism of ISSR primers

2.2 长柄链格孢菌菌株的遗传多样性分析

2.2.1 长柄链格孢菌不同地理来源菌株的遗传多样性由软件POPGENE（version 3.2）计算得出不同种群菌株的平均多态位点数为55，Nei’s 多样性指数为0.1118 ～0.2061，Shnanon 信息指数为 0.1972～0.3177；其中十堰菌株的Nei’s多样性指数为0.2061，Shnanon信息指数为0.3177，为4个地理种群中最高；而宜昌菌株的Nei’s多样性指数为0.1118，Shnanon 信息指数为0.1689，相对其它地理种群较低（表3）。上述结果表明长柄链格孢菌不同地理种群之间有丰富的遗传多样性。

表3 基于ISSR标记的长柄链格孢菌遗传多样性Tab.3 Genetic diversity of A. longipes based on ISSR marker

2.2.2 长柄链格孢菌不同地理种群的遗传距离分析

湖北省烟草赤星病长病链格孢菌总基因遗传多样性为0.1815，种群内遗传多样性为 0.1605，种群间遗传分化系数为0.1305，居群每代迁移数（Nm）为3.2740（表4）。通过对4个不同产烟区种群的基因分化系数（Gst）分析，种群内遗传多样性变异占85.34%，表明菌株的遗传变异主要存在种群内。4个不同地理种群的居群每代迁移数（Nm）为3.2740＞1，表明在不同地理来源的种群间存在广泛的基因流动，从而阻碍了由遗传漂变所导致的遗传分化。

表4 长柄链格孢菌株基因多样性的 Nei’s 分析Tab.4 Nei’s analysis of genetic diversity of Alternaria longipes strains

种群间的遗传距离结果见表5。4个地理来源种群的遗传距离平均值为0.03915，遗传相似性平均值为0.9616。十堰和恩施的种群遗传距离最大为0.0503，而襄阳与十堰种群的遗传距离最小为0.0282。

表5 长柄链格孢菌种群间Nei’s遗传相似性（I，上三角）及遗传距离（D，下三角）Tab.5 Nei’s genetic similarity (I, upper triangle) and genetic distance (D, lower triangle) between populations of A. longipes

根据种群间遗传距离结果，按照非加权算术平均（UPGMA）法绘制4个不同种群间聚类分析树（图3），4个种群可以分为两类，十堰和襄阳的聚为一类，恩施和宜昌的聚为一类。

图3 长柄链格孢菌株病菌种群ISSR聚类分析图Fig.3 ISSR clustering analysis of A. longipes strains

2.2.3 烟草长柄链格孢菌（A. longipes）ISSR聚类分析结果

由NTSYSpc-2.10软件构建UPGAM的聚类分析树（图4）可以看出，供试的34株长柄链格孢菌株具有较高的遗传相似性，其相似系数为0.52～0.99。当相似性系数设定为0.79时，可将34个供试菌株分为4个类群：第1类群包括襄阳保康的1个菌株XYBK-910-2；第2个类群包括了31个菌株，是优势类群，菌株来自襄阳、十堰、恩施和宜昌4个烟叶产区；第3个类群只有来自恩施利川市的1个菌株ESLC-1410-1；第4个类群是来自十堰市郧西县的1个菌株SY-YX-920-1。34株供试长柄链格孢菌株并没有以不同地理来源完全聚为不同的组。

图4 34个长柄链格孢菌株的ISSR树状聚类图Fig.4 UPGMA dendrogram of 34 A. longipes strains

3 讨论

国内外利用ISSR分子标记技术对链格孢菌的遗传多样性进行了研究[22-24]，其中祖艳青[11]和胡中会[18]采用该方法研究了赤星病菌遗传多样性和地理来源的关系，但并没有对种群的遗传分化和种群的遗传变异做进一步分析，李六英[25]研究了链格孢菌和长柄链格孢菌的遗传多样性及遗传分化，结果发现链格孢菌的遗传多样性与地理来源有明显的相关性，但长柄链格孢菌的研究结果相反，其初步分析了2个种的遗传分化特点，但未对遗传分化结果和种群的遗传变异做深入研究。本研究从遗传多样性、遗传结构与分化和种群的遗传变异多方面对湖北省烟草赤星病优势致病种进行了分析。

本研究对湖北省4个烟区34个长柄链格孢菌的遗传多样性参数进行统计分析，结果表明菌株遗传多样性处于相对较高的水平，但是不同地理种群间遗传多样性水平不一样，差异并不显著。另外烟草种植环境和品种的选择往往能够诱导赤星病致病菌等位基因的变异，导致遗传结构的分化，其分化的程度利用遗传分化指数、遗传距离等进行度量，数值越大，表明群体间的遗传分化水平越高[26-28]，本研究中，4个地理来源种群的遗传分化系数为0.1305，遗传距离平均值为0.03915，表明种群间产生了一定程度的遗传分化。此外，Wright[29]认为当种群间的居群每代迁移数（Nm）大于1时，表明群体间的基因流动发生多，若小于1，则基因流动少，遗传分化明显；4个不同地理种群的Nm为3.2740＞1，说明4个地理种群存在不同程度的基因交流，可能是由于种植地点都在山区且气候相似，遗传分化的程度不明显。

由NTSYSpc-2.10软件对34个供试菌株构建UPGAM的聚类分析树可知，当相似性系数设定为0.79时，可将供试菌株分为4个类群：其中第1、3、4类群的菌株分别来至不同烟区，进一步说明各烟区种群间存在一定程度的遗传分化；但第2种群的31个菌株来至4个烟叶产区，菌株并没按照地理来源聚为不同的组，表明菌株之间的遗传多态性与其地理来源无明显的相关性。

4 结论

本研究采用ISSR分子标记方法对湖北4个烟区的34株长柄链格孢菌进行了遗传多样性分析，结果表明种群间有丰富的遗传多样性，但菌株之间的遗传多样性与其地理来源无显著相关性；4个烟区的菌株产生了一定程度的遗传分化，但分化的程度不高。该研究通过分析湖北省烟草长柄链格孢菌的遗传多样性、遗传结构分化以及遗传多样性与地理来源的关系，为后期烟草赤星病的防治奠定了理论基础。