LC-MS/MS法测定烟草中7种高级脂肪酸

马丽伊，徐志强，田振峰，赵爱侠，淦五二*

1 中国科学技术大学化学系，合肥 230026；

2 安徽中烟工业有限责任公司技术中心，合肥 230088

高级脂肪酸对烟叶品质具有重要影响[1-6]，并且是评价烤烟品质的有效指标[6]。烟草中饱和高级脂肪酸能增加烟气的脂肪或蜡味，其中，肉豆蔻酸能柔和烟气，与烟香谐调，提高甜而醇和的风味；棕榈酸有甜的蜡脂气息，能增加丰满度；但亚油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸会增加烟气刺激性[7]。

烟草及烟草制品中高级脂肪酸的测定方法主要有气相色谱法[8-11]和液相色谱法[12-13]。采用气相色谱分析时，衍生化样品操作较麻烦，处理步骤多，而且会对样品造成损失。对于液相色谱法来说，由于脂肪酸紫外吸收很弱，用紫外检测器检测时需柱前衍生化，但在衍生过程中易发生异构化、氧化、分解等副反应且很难保证衍生化完全。用蒸发光散射检测器可直接检测脂肪酸，但灵敏度低，无法检测到低含量的高级脂肪酸。

液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测灵敏度高、选择性好，是非挥发性成分定性、定量测定的有效手段[14-15]。本文建立了一种快速、准确的LC-MS/MS测定高级脂肪酸检测方法。所研方法样品前处理相对简单，无需衍生化，提取的样品可直接进样分析，适用于分离、定量烟草中高级脂肪酸。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

（1）试剂：十七烷酸（98%）、亚麻酸（99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），油酸、棕榈酸、肉豆蔻酸（分析纯，国药集团有限公司），硬脂酸（98%，英国Alfa Aesar 公司），月桂酸、亚油酸（99%，美国Acros Organics 公司），氢氧化钾、盐酸（分析纯，国药集团有限公司），其余所用试剂均为色谱纯。烟叶样品： 不同等级（C2F，B2F，X2F，X3F，C3F）烤烟样品来自云南梁河。

（2）仪器：Symbiosis Pico高效液相色谱仪（荷兰Spark公司），4000 Q Trap质谱仪（美国AB公司），Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司），AL204-IC型电子分析天平（0.1 mg，瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取7种高级脂肪酸标准品各10 mg，用甲醇溶解定容至50 mL，制得0.20 mg/mL单一标准储备液。用甲醇准确配制混合标准储备液（月桂酸：1.0 μg/mL；肉豆蔻酸：2.0 μg/mL；棕榈酸：50 μg/mL；硬脂酸：10 μg/mL；亚麻酸：60 μg/mL；亚油酸：42 μg/mL；油酸：20 μg/mL）储存于棕色玻璃瓶中。

准确配制十七烷酸（0.20 mg/mL）内标标准储备液，取一定量的内标储备液，用甲醇稀释定容，制得内标工作液（10 μg/mL）。

1.3 样品处理与分析

称取样品0.5 g于100 mL 圆底烧瓶中，加入40 mL含3 mol/L KOH的甲醇溶液，于60℃水浴中回流皂化60 min，冷却至室温。过滤溶液至锥形瓶中，加入20 mL水，混匀，用36%(质量分数)盐酸调节滤液pH值至3.0 ～ 4.0。用含内标的二氯甲烷溶液萃取3次，每次15 mL，合并二氯甲烷层，以30 mL超纯水反萃取有机相，将有机相用氮气吹干，残余物用甲醇溶解并定容至50 mL，移取0.2 mL上述甲醇溶液稀释至10 mL，经0.22 μm有机相滤膜过滤后进行LC-MS/MS分析。

1.4 仪器条件

色谱条件：Hypersil Gold C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3 μm），流动相 A：5%(ν/ν)缓冲溶液的水溶液；流动相 B：5%(ν/ν)缓冲溶液、55%(ν/ν)乙腈、40%(ν/ν)异丙醇。缓冲溶液配制：用浓氨水调节100 mM冰醋酸至pH=5。运行时间30 min，柱温20℃，进样体积 5 μL。梯度洗脱条件：0 ～ 20 min，70%B～100% B；保持 5 min；25～30 min，100% B～70% B，流速为0.2 mL/min。

质谱条件：电离方式为电喷雾负离子模式（ESI-）；离子源温度：550℃；电喷雾电压：-4000 V；气帘气：10 psi；扫描时间：0.1 s；离子源辅助气1：50 psi；离子源辅助气2：50 psi；检测方式：“准分子”多反应监测过渡（即采用相同的离子作为母离子和子离子）。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的建立

LC-MS/MS定量测定高级脂肪酸常用检测模式有MRM[15]（多反应监测）和SIM[16-17]（选择离子扫描）模式。MRM模式分析高级脂肪酸虽然可以减少烟草中基质干扰，但分析物在负离子模式下，加碰撞能产生的碎片离子灵敏度很低，无法满足定量条件的要求。SIM模式比MRM模式在高级脂肪酸分析中有更好的灵敏度，但对于烟草样品会有更多的分析干扰。“准分子”MRM过渡模式是采用相同的离子作为母离子和子离子，既解决了分析干扰因素又提高了分析灵敏度。本文比较了以上3种检测模式，结果如表1所示。从表1可知，“准分子”MRM过渡模式响应值高于MRM模式，与SIM模式相比，大部分目标物响应值略高。因此，本文采用“准分子”MRM过渡模式。

表1 “准分子”MRM过渡、SIM和MRM模式对比Tab.1 Comparison of the MRM, SIM and “Pseudo-molecular” MRM transition mode

2.2 离子源优化

本文分别采用ESI源和APCI源进行离子源优化。由图1可以看出，除棕榈酸外，其它被测物的ESI源信号强度均高于APCI源，因此本文采用ESI源。

图1 对比使用ESI和APCI接口目标化合物的灵敏度Fig. 1 Sensitivity of the target compounds using the ESI and APCI interfaces

采用负离子模式对标准样品进行一级质谱分析，从而确定母离子。然后对各质谱条件进行优化，以提高灵敏度使得信号稳定。最终确定质谱最佳检测条件，各化合物的优化结果如表2所示。

表2 质谱优化条件Tab.2 Investigated compounds with their specific MS/MS parameters

2.3 流动相的选择

实验考察了甲醇-水，乙腈-水，缓冲溶液的水溶液-乙腈/异丙醇/缓冲液体系作流动相对分离效果的影响。结果如图2所示，乙腈-水作为流动相时，峰型较差，响应较低；甲醇-水作流动相时的峰型较好，响应较高，干扰峰较少，但目标物不能有效分离。改用A相为5%缓冲溶液的水溶液，B相为5%缓冲溶液、55%乙腈、45%异丙醇作流动相。加入缓冲盐溶液调节溶液pH值高于pKa使得脂肪酸易脱质子产生负离子，加入异丙醇后调节有机相极性，实现了各目标物完全分离，且具有较好的方法灵敏度。因此选用此条件作为流动相分析条件。

2.4 前处理过程的优化

根据文献报道[13]，选择甲醇作皂化溶剂，分别对氢氧化钾浓度，皂化温度，反应时间，萃取剂提取效率和萃取剂体积进行优化。考察了皂化温度分别为40，50，60和70℃时对各化合物测定值的影响。结果表明，当皂化温度从40℃增加到60℃时，各物质的测定值显著增加，继续升高温度，各物质含量变化趋于平缓。因此选择皂化温度为60℃。分别比较了反应时间为20，40，60和80 min时的各化合物测定值。结果表明，随着反应时间的增加，各化合物测定值逐渐增加。当反应时间从60 min增加到80 min时，各物质测定值变化不大。表明反应时间为60 min时皂化反应进行完全。因此选择反应时间为60 min。

图2 三种流动相对比图。a b c分别为甲醇-水，乙腈-水，缓冲溶液的水溶液-缓冲溶液/乙腈/异丙醇作流动相，a b c为硬脂酸色谱图，d e f为油酸色谱图Fig. 2 Comparison of LC-MS/MS chromatograms of three mobile phases a MeOH-H2O, b MeCN-H2O, and c buffer/H2O(5/95)-buffer/MeCN/IPA(5/55/40); a b c Stearic acid chromatogram, d e f Oleic acid chromatogram

2.4.1 氢氧化钾浓度的选择

分别用1、2、3、4 mol/L KOH的甲醇溶液进行皂化实验（表3）。结果显示KOH的甲醇溶液浓度由1 mol/L上升到3 mol/L 时，高级脂肪酸的测定值显著增大，随后趋于平缓。因此本文选用3 mol/L KOH的甲醇溶液作皂化溶剂。

表3 不同浓度KOH的甲醇溶液下各高级脂肪酸的测定值Tab.3 Effect of KOH-CH3OH concentration on high fatty acids mg/g

2.4.2 萃取溶剂的选择

本实验选取了环己烷、无水乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷作为萃取液优化高级脂肪酸萃取条件，发现无水乙醚和乙酸乙酯不能与水相较好地分层，因此比较了环己烷、二氯甲烷、正己烷对目标物萃取效率的影响。为防止环己烷、二氯甲烷、正己烷溶剂和流动相不匹配，将萃取液用氮气吹干后用甲醇定容，在相同条件下进行分析，结果见图3。对于肉豆蔻酸和亚油酸，环己烷萃取效率略高，但其他化合物二氯甲烷萃取效率最高，因此最终选用二氯甲烷为萃取溶剂。

图3 不同提取试剂对各高级脂肪酸的影响Fig.3 Effect of extraction reagents on high fatty acids

2.4.3 萃取溶剂体积选择

固定样品量为0.5 g，分别比较了萃取溶剂体积为10、12、15、18 mL时的萃取效率（表4）。结果表明，随着萃取溶剂增加，提取出的被测物含量逐渐增加。当萃取溶剂达到15 mL时萃取基本完全。因此使用萃取溶剂体积为15 mL。

表4 不同体积萃取溶剂下各高级脂肪酸的测定值Tab.4 Effect of Extraction Solvents Volume on high fatty acids mg/g

2.5 方法的标准曲线、精密度及回收率

准确配制系列混合标准溶液，按照1.3所述条件进行LC-MS/MS分析，混合标准溶液选择离子流图如图4所示。内标法线性回归得到标准曲线方程、相关系数、回收率、LOQ（表5）。各目标化合物具有良好的相关性，适合定量分析。将最小浓度的标准溶液重复进样10次得到标准偏差，以3倍标准偏差为方法的检测限，10倍标准偏差为定量限。各物质的LOD范围为0.0004～0.007 mg/g，LOQ范围为0.001～0.02 mg/g。在空白样品中添加7种高级脂肪酸混合标样，添加浓度0.02～1.2 mg/g之间，重复进行5次实验，得出平均回收率为87.5%～109%，相对标准偏差在 1.1%～4.7%之间（表5）。

图4 混合标样和内标选择离子流色谱图Fig.4 Chromatogram of mixed standard and internal standard

2.6 本方法与气质方法比较

分别采用GC-MS[11]和LC-MS/MS法测定高级脂肪酸（表6）。结果表明，在线性范围内，相关系数均大于0.98，说明两种方法均具有良好的线性关系。LC-MS/MS灵敏度优于GC-MS，但回收率和精密度略差于GC-MS，两种方法均满足定量分析要求。高级脂肪酸属于低挥发性物质，因此不适合直接进行GC-MS分析，需进行衍生化，反应时间2 h，衍生化副产物较多，有时可干扰目标物的检出，且无法分别定量亚麻酸和油酸。而LC-MS/MS法皂化后直接测定，无需衍生化，减少样品用量，分离时间快且有效缩短检测时间。

对于高级脂肪酸含量测定，本方法是通过皂化使烟草中酯结合态脂肪酸转化为游离态脂肪酸，经提取得到烟草中总的脂肪酸含量；而GC-MS方法是通过酯化使游离态脂肪酸转化为酯结合态脂肪酸，经提取后得到总的脂肪酸含量。比较上述两种方法对烟草样品进行分析（表7）。由表7可知，两种方法测定样品均未检出月桂酸，不同烤烟中高级脂肪酸含量存在一定差异。本文方法测定样品中高级脂肪酸含量分别为：肉豆蔻酸（0.018～0.073 mg/g）、棕榈酸(1.43～1. 87 mg/g)、硬脂酸(0. 24～0. 55 mg/g)、亚麻酸(2.17～2.99 mg/g)、亚油酸(0.56～1.28 mg/g)、油酸(0. 43～0. 86 mg/g)。气质测定结果为肉豆蔻酸（0.019～0.055 mg/g）、棕榈酸(1.63～2.19 mg/g)、硬脂酸(0.37～0.46 mg/g)、亚油酸(1.12～1.64 mg/g)、亚麻酸+油酸(2.55～3.78 mg/g)。总体看来，对于肉豆蔻酸，液质方法测定含量高于气质方法，其他化合物气质测定含量高于液质。

表5 7种高级脂肪酸的相关参数Tab.5 Quality parameters of 7 high fatty acids

表6 比较2种高级脂肪酸的测定方法Tab.6 Comparison of two methods for the determination of high fatty acids

表7 比较2种方法测定烟草样品中高级脂肪酸含量Tab.7 Comparison of two methods for the determination of high fatty acids in tobacco mg/g

3 结论

建立了一种高效液相色谱－串联质谱内标法测定烟草中高级脂肪酸含量的方法。该法快速、准确，具有精密度高、准确度好、操作简单等特点，避免了衍生化处理对样品造成损失的问题，满足烟草中高级脂肪酸定量分析。