右归丸对肾阳虚大鼠精子的作用

谢怡敏，姚欢

右归丸最早载于张景岳先生的《景岳全书》[1]：大怀熟八两;山药炒四两;山茱萸微炒三两;鹿角胶炒珠四两;菟丝子炙四两;杜仲姜汁炒四两;当归三两;肉桂二两;制附子二两。每嚼服二、三丸。以滚白汤送下,其效尤速。方中附子、肉桂、鹿角胶培补肾中之元阳,温里祛寒,为君药。熟地黄、山茱萸、枸杞子、山药滋阴益肾,养肝补脾,填精补髓,取“阴中求阳”之义,为臣药。正如张介宾所言:“善补阳者,必于阴中求阳,则阳得阴助,而生化无穷。”佐以菟丝子、杜仲补肝肾,健腰膝;当归养血和血,与补肾之品相配,以补养精血。诸药合用,肝脾肾阴阳兼顾,仍以温肾阳为主,妙在阴中求阳,使元阳得以归原,故名“右归丸”。本方从肾气丸中减去“三泻”,而加入大队补药,这就使药效专于温补。同时,将肾气丸中干地黄改为熟地黄,也使此方温性大增,而不同于肾气丸的平补。

本实验拟以右归丸治疗肾阳虚大鼠，观察其精子活动率改变及睾丸和附睾的重量、血液中睾酮的检测，考察右归丸对肾阳虚大鼠精子的作用。

1 材料与试剂

1.1 药材

右归丸基本药物组成:熟地黄24 g、山药12 g、山茱萸9 g,枸杞子9 g、菟丝子12 g、鹿角胶12 g、杜仲12 g、肉桂6 g、当归 9 g、制附子6 g、淫羊藿12 g、补骨脂12 g。药材购于成都杏林药房，打磨成粉剂，用双蒸水溶解，根据中华人民共和国药典，每公斤体重10.26 g灌胃给予实验动物。

1.2 试剂

氢化可的松，天津金耀氨基酸有限公司，批号：1106021。

1.3 实验动物

成年雄性SD大鼠，SPF级，体重约200 g，由四川成都达硕生物科技有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2013-24。

2 方法

2.1 造模及分组

实验动物的制备：随机将动物分为正常对照组，肾阳虚组，肾阳虚右归丸治疗组三组，肾阳虚组（5只），大腿内侧肌肉丰富处注射氢化可的松25 mg﹒(kg﹒d)-1,连续21天。正常对照组按2 mL﹒d-1，皮下注射生理盐水，连续21天。肾阳虚右归丸组模型组造模方法同肾阳虚组，第8天开始右归丸组每天灌胃右归丸，共14 d[2]。正常组和模型组以生理盐水灌胃。

2.2 睾丸、附睾称重及精子的获取

断脊髓法处死大鼠，迅速取睾丸和附睾，先用生理盐水洗去粘附的毛发和血液等，滤纸吸干，双侧睾丸、附睾称重。将一侧附睾尾置于装有培养液的EP管中，用小剪刀将附睾尾煎碎，放入37℃孵箱30 min后，制备精子悬液。

2.3 精子活动度检测

将精液用Ham’s F-10培养液（Hyclone公司）稀释后，调节密度至1×107个/mL，每份精子标本分为两个标本，用计数器计算每类精子的数目，向血细胞计数板的每个计数槽加入10 μL的精子标本。按WHO方法检测A级精子比率，B级精子比率[3]。

A 快速前向运动（37℃，速度≥25 um/s）；B慢速或呆滞的前向运动

C 非前向运动；D 不动

2.4 ELISA法测血清T的含量

各组大鼠心脏取血，待血液凝固后吸取血清，设置空白/标准和待测孔，标准孔加样50uL,待测孔加入待测血清10 μL和样品稀释液40 μL，37℃孵育30 min，洗涤液洗涤5次，每孔加入50 μL酶标试剂，空白孔除外，37℃，30 min；洗涤5次，每孔先加入显色剂A50 μL，再加入显色剂B50 μL，轻轻混匀，37℃避光显色10 min后，加入终止液50 μL，用酶标仪测定450 nm各孔的吸光度。绘制标准曲线，按照每组样本的A450，查出各自的浓度。

2.5 统计学分析 利用软件SPSS 21.0进行数据分析 各组间采用方差分析，P＜0.05认为有显著差异。

3 结果

3.1 各组大鼠表现

空白组大鼠无异常，明显较另外两组大鼠状态好，皮毛光泽，活跃好动，精神良好。肾阳虚组大鼠倦怠，运动减少，注射部位出现脱毛，食欲下降，体温降低。肾阳虚加右归丸组状态居于未见明显异常，但活动度不如空白组，较肾阳虚组要好。

3.2 各组大鼠睾丸、附睾重量比较

结果如表1所示，模型组和右归丸组睾丸较正常组明显减少，模型组和右归丸组未见明显改变。附睾重量正常组和右归丸组明显高于模型组。

表1 各组大鼠睾丸、附睾重量比较

3.3 精子活动度检测

结果如表2所示，A、B级精子正常组和右归丸组明显高于模型组。

表2 各组大鼠A、B级精子比例

3.4 血清T水平检测

结果如表3所示，血清T含量正常组和右归丸组明显高于模型组。

表3 各组大鼠血清T检测

4 讨论

目前世界上约6～8千万对不育夫妇,占已婚夫妇的10%～15%左右,其中40%～50%为男性不育,且有逐年增多的趋势。我国约有10%的夫妇患有不育症,全国男性不育者约有5000万人(2010年)。肾阳虚是造成男性不育的最重要原因。

肾为脏腑之本，十二经之根，与命门同一气。肾阳对各脏腑有推动和温煦作用，能提升脏腑之阳，如果肾阳不足，会引起很多脏器功能不足，如神疲乏力，精神萎靡，手脚冰冷，疲劳嗜睡，腰膝酸软，神疲乏力，夜尿多，性功能减弱，阳痿早泄，舌淡苔白，脉弱等。肾阳虚证为中医的基本证型之一，有研究发现右归丸对肾阳虚的作用机制与现代医学的下丘脑-垂体-性腺功能有关，还有研究发现肾气丸、五子衍宗丸等对肾阳虚大鼠精子功能有明显改善[4]，我们用右归丸对肾阳虚大鼠的作用结果说明右归丸对肾阳虚所致内分泌生殖功能紊乱也有明显的改善。右归丸是明代儒医张介宾的名方。在张介宾的《景岳全书》卷51用于治疗肾阳不足，命门火衰的常用方。现今多用于治疗性功能减退、肾病综合征及腰肌劳损等肾阳虚症。方中附子、肉桂辛热入肾,温壮元阳；淫羊藿、补骨脂温补肾阳。

睾酮主要由睾丸的间质细胞分泌，并能与FSH一起促进睾丸的曲细精管的发育及产生精子并维持附睾中精子的成熟，刺激并保持第二性征的出现。睾酮也是附睾、输精管、精囊和前列腺等发育和成熟所必须的，睾酮进入前列腺后，经5a-还原酶的作用生成活性更强的双氢睾酮，睾酮的分泌受下丘脑-垂体-性腺轴的调节[5]。

本研究采用右归丸治疗肾阳虚大鼠，可明显增加肾阳虚大鼠的附睾重量、A级和B级精子比率级睾酮含量，说明右归丸对肾阳虚大鼠的生殖内分泌有明显治疗作用。