色谱法分析重组单克隆抗体电荷异质性应用进展

任华景，刘晓志，杜 力，高 健，王志明

0 引言

单克隆抗体由2条重链2条轻链组成，相对分子质量高达150 kDa左右，结构复杂。目前，单克隆抗体大多是采用哺乳动物细胞表达系统进行生产，单克隆抗体在生物化学和生物物理方面是异质的，这主要取决于复杂的翻译后修饰和降解事件[1]，导致了产品的分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生[2]。采用一些电荷分离技术如等电聚焦(IEF)凝胶电泳、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、阳离子交换色谱(CEX)、阴离子交换色谱(AEX)分析单抗会发现变体，这些变体被称为酸性或碱性物质。IEF方法分析单抗，低于等电点(PI)的为酸性变体，高于PI的为碱性变体。基于色谱法分析，酸性和碱性物质界定是通过主峰的保留时间。CEX方法检测酸性物质变体峰比主要物质峰先洗脱出来，碱性变体峰比主要物质峰晚洗脱出来；AEX方法检测酸性物质变体峰比主要物质峰晚洗脱出来，碱性变体峰比主要物质峰早洗脱出来。

尽管有学者同意采用等点聚焦电泳和层析图谱方法来计算酸性和碱性物质的量，但由于分离机制的不同，计算这些物质的量仍存在区别。IEF分离抗体变体是基于总电荷的不同(表观PI)，但是，除总电荷外，在通过色谱法分离抗体变量时发现电荷分布也起着关键作用，这可能影响抗体和介质的相互作用。IEF和离子交换(IEX)的不同已有报道[3]。如：鼠抗片段通过弱阳离子交换柱分离出峰的保留时间不同，但是采用IEF分析显示了相同的PI[3]。人鼠嵌合体单抗的Fab片段无论是在轻链上还是在重链上都有焦谷氨酸，所以没有发现不同的PI，可以通过强阳离子交换(SCX)来分析。这些例子说明基于色谱法分离不仅仅依赖于所有的电荷分布，在不存在电荷分布不同的情况下，一样可以达到分离的效果。不过主要的分离动力还是来自于电荷分布的不同。

在重组单克隆抗体的生产、储存、运输等过程中，往往会发生产品的聚集、降解及各种翻译后修饰，从而导致产品的分子大小、电荷、糖基化修饰等不均一性及其相应的变体产生[4]。电荷变体主要影响抗体体内和体外性状。已经被证实抗体使用化学修饰能改变结合蛋白或细胞膜靶标，从而影响组织穿透、组织分布和药代动力学(PK)[5]。变体的作用高度依赖于性质，翻译后修饰的位置和程度，而最终这些变体形成了酸性和碱性物质。

本综述主要基于色谱技术收集变体来分析描述酸性和碱性物质[6]，酸性和碱性物质通常由IEF和cIEF观察到，从IEF和cIEF收集足够的材料用于详细描述是具有挑战性的。

1 单克隆抗体的主要物质

抗体中的主要物质在色谱中主峰的位置洗脱。主要物质不一定对应于未修饰或者未降解的抗体。主峰通常是由具有3种典型的翻译后修饰的抗体种类组成：①N-末端谷氨酰胺(Gln)环化为pyroGlu；②去除重链C-末端赖氨酸(Lys)；③带有中性寡糖的CH2结构域中保守的天冬酰胺(Asn)残基的糖基化。主要物质将作为对酸性和碱性物质详细表征的重要控制。

1.1 N-末端Gln环化作用 N-末端Gln在轻链和重链之一或两者的基因中编码，其可以在合成后自发地环化形成pyroGlu。色谱法分析时发现大多数抗体含有N-末端pyroGlu而不是原始Gln，因此作为主峰洗脱[7-8]。

1.2 C-末端赖氨酸去除 同样，重链C-末端的Lys在重链基因中编码。羧肽酶处理后导致的不完全去除的C-末端使得抗体携带0、1或2个C-末端赖氨酸残基[9]。通常在主要物质中发现没有任何C-末端赖氨酸的抗体[10]。

1.3 N-连接的寡糖糖基化 在CH2结构域中保守的Asn残基用N-连接的寡糖糖基化，从哺乳动物细胞中获得的重组单抗主要糖型是核心岩藻糖苷复合物双天线结构，带有0、1、2个末端半乳糖残基。

2 单克隆抗体的酸性物质

酸性物质是抗体的变体，用CEX-HPLC法分析发现其比主峰早洗脱出来，用AEX法则比主峰晚洗脱出来。形成酸性物种的主要原因如下。

2.1 唾液酸 唾液酸一般是构成了酸性物质。在NS0细胞中表达的重组IgG1抗体中的酸性级分中检测到唾液酸[8]。在CHO细胞表达的重组IgG1抗体中的酸性级分中也检测到了高水平的唾液酸[11]。唾液酸酶处理后，用CEX-HPLC分析山羊表达的重组单克隆抗体时，发现酸性物质的百分比更低，表明唾液酸的存在是这些酸性物种的主要原因[10]。采用CEX分析时，在IgG4抗体的酸性区域中也检测到了唾液酸[12]。

2.2 天冬酰胺残基的脱酰胺化 天冬酰胺残基的脱酰胺化可能为酸性物质产生的主要原因。脱氨发生在可变结构域，特别是在暴露的和灵活的互补决定区(CDR)中以及在恒定结构域中。CDR区残基的脱酰胺化几乎保证了酸性物质的产生[13]。Asn残基的脱酰胺在CH3的不变区域具有氨基酸序列SNGQPENNYK已被广泛报道。尽管来自每个位点的特定产物仍然有争议，但通常认为脱酰胺化仅发生在该序列的第1和第2个Asn残基处[14]。恒定区中Asn残基的脱酰胺化也最可能导致酸性物质的形成[15]。

2.3 其他修饰 其他修饰也可能导致酸性物质的产生。如：通过CEX分析时，具有非经典二硫键的IgG2(IgG2B和IgG2A /B)比具有经典键联(IgG2A)的分子早洗脱[16]。使用AEX分析时，首先，在重组人IgG2中鉴定的含有三硫键的抗体比主峰洗脱晚，因此认为对应的是酸性物质[17]。研究显示，具有高甘露醇含量的抗体变体在重组单抗的酸性部分中富集，但是在高甘露糖寡糖和具有核心岩藻糖的复合双触角寡糖之间没有电荷差异，这也证明了色谱法分离不仅基于电荷差异，而且还基于微妙的构象差异[18]。已经用于制剂以防止由曝光引起氧化的硫代硫酸盐可以与抗体反应以形成酸性物质[19]。糖基化、还原糖和Lys残基的侧链或N-末端伯胺之间的反应由于中和了正电荷，导致酸性物质的产生[20]。

3 酸性物质对结构、稳定性和功能的影响

由于导致产生酸性物质的各种修饰对结构、稳定性和功能的潜在影响高度依赖于其位置。由于柔性铰链区，位于Fc区中的修饰可能对Fab片段没有显著影响。如：唾液酸的存在不影响抗体效力[7]，但是对抗原结合和效力具有实质性影响。CDR区中的脱氨基化导致抗原结合亲和力和重组单克隆抗体的效力降低[6]。糖基化增加聚集体的形成而不改变抗体构象[21]，表明由Lys的糖基化引起的表面正电荷降低可能导致抗体分子之间的较低排斥。另外，具有半胱氨酰化反应的抗体显示出降低的热稳定性，更容易形成聚集体。

4 单克隆抗体的碱性物质

碱性物质在CEX-HPLC分析中比主要物质峰晚洗脱出来，而在AEX-HPLC分析中早于主要物质峰洗脱出来的物质。形成碱性物质的一个主要原因归纳如下。

4.1 C末端Lys不完全去除 形成碱性物质的一个主要原因是不完全去除C末端Lys。具有重链C末端Lys的单抗，由于额外的正电荷，而比主要物质更偏碱性[22]。由于羧肽酶B(CPB)能够特异性地去除C-末端碱性氨基酸残基，因此比较CPB消化前后抗体的色谱图，可以清楚地证明C末端Lys对碱性物质形成的贡献。

4.2 N末端Gln与轻链或重链或两者的pyroGlu的不完全环化 碱性物质形成的另一种常见的修饰是N末端Gln与轻链或重链或两者pyroGlu的不完全环化。Gln最初编码在基因中，但其可以经历自发反应以产生pyroGlu。具有原始Gln抗体的表观pI高于主要物质，因此被称为碱性物质[23]。

4.3 脱酰胺化 与脱酰胺相似，异构化频繁发生在CDR区域，很少在恒定区域发生[24]。经CEX分析后，重链CDR3中的带有isoAsp 102的重链单克隆抗体比带有原始Asp的抗体晚洗脱出来[25]。作为Asn脱酰胺和Asp异构化的常见中间体的琥珀酰亚胺也可以有助于产生碱性物质[18]。

4.4 其他修饰 几种其他修饰可以产生碱性物种。通过CEX-HPLC分析时，抗体Fc区中两个保守的甲硫氨酸(Met)残基的氧化在碱性区域得到洗脱[26]。在重组单抗的CDR2区域中的Met残基的氧化还导致碱性物质的产生[26]。去除重链C-末端Lys后脯氨酸残基的酰胺化导致碱性物质的形成[27]。在轻链或重链的Fc区，具有从丝氨酸到精氨酸的单个氨基酸突变的重组单抗作为碱性物质从CEX柱洗脱[28]。具有一个糖基化重链和一个具有短寡糖的重链的抗体也作为碱性物质从CEX柱洗脱[29]。

5 碱性物质对结构、稳定性和功能的影响

抗体的N-末端或C-末端的修饰对抗体结构、稳定性和功能具有实质性影响，因为这些区域是高度暴露的，并且不是任何配体结合位点的一部分。研究已证明琥珀酰亚胺形成对抗原结合亲和力和效力的影响，在重链CDR2中含有琥珀酰亚胺的Fab片段结合亲和力降低，与具有原始Asn的抗体相比，具有琥珀酰亚胺的抗体显示出的效力有所降低[26]。

Fc区域中甲硫氨酸残基的氧化不影响重组单抗的抗原结合与效力；然而，其确实引起主要在CH2结构域中的构象变化，导致热稳定性降低和聚集倾向增加[30]。热稳定性降低通过差示扫描量热法(DSC)测量重链CDR2区域Met残留的氧化得到证实[31]。

6 结论

制备出重组单抗样品时，通常能观察到酸性和碱性物质。完全消除酸性和碱性物质是不现实的和不必要的。对于与特异性宿主表达系统相关的重组单抗，一些蛋白修饰是特有的(如：通过山羊乳中的马来酸修饰)，还有一些蛋白修饰是在蛋白生产和配制过程中发生的(如：硫代硫酸盐修饰)。其对生物功能的影响高度依赖于位点和修饰水平。对于局限于Fc区的修饰，即使存在较高水平也不会对结合亲和力有直接影响。类似地，局限于Fab区的修饰可能不影响Fc相关功能，如：受体结合。修改的水平对于效果有很大的影响。如：Asn55的脱酰胺度较低在重链CDR区域不影响一种抗体的效力[7]，但是一条重链中的isoAsp55或Asp55可将另一种抗体的效力降低[26]。脱酰胺对2种抗体影响的区别可能是由于与其相互作用的抗原不同，此外，脱酰胺占百分比也起了重要作用。通过色谱法分析已鉴定出导致酸性和碱性电荷变体的修饰，但解酸性和碱性变体的性质仍不明确。因此，在单克隆抗体研发和制备的过程中，必须要评估酸性或碱性变体对主要物质的稳定性和功能的影响。修饰可能是关键质量属性(CQA)或关键过程属性(KPA)。因此，为了确保治疗性重组单克隆抗体的有效性和安全性，分析酸性和碱性物质的产生至关重要。

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