基于CHD基因和EE0.6基因遗传多态鉴定白枕鹤、丹顶鹤性别研究报告

孙志明徐 琪徐 禄倪谷音王金美

(1.无锡市动物园管理处，无锡，214151；2.扬州大学动物科学与技术学院，扬州，225009)

白枕鹤(Grusvipio)是国家Ⅱ级保护动物，IUCN将其列为易危(VU)，丹顶鹤(Grusjaponensis)是国家Ⅰ级保护动物，IUCN将其列为濒危(EN)，受到动物饲养、保护机构的高度重视和保护。这2种鹤均为单态性鸟，两性形体相似，它们的性别无论是幼鸟还是成鸟都很难从外观或行为上进行准确鉴定，在人工养殖时，给配对造成很大困难。目前这2种鹤无论是野外数量还是圈养数量都没有明显上升，圈养条件下成功地鉴定性别可人为提高鹤类配对指数和繁殖率。

目前在鹤类上常见性别鉴定方法主要有利用繁殖季行为特征观察、泄殖腔翻检、粪便中雌激素与睾酮比例的测定、染色体分析、内窥镜探测等，但是这些方法准确度都不高，且有的伤害性大、有的费时费力。随着鸟类基因组研究发展，多个基因在非平胸鸟类W、Z染色体上均存在差异，如染色体螺旋蛋白基因(Chromo-helicase-DNA-Binding gene，CHD)。该基因在非平胸鸟类上有2个同源拷贝CHD-W和CHD-Z，而两者的外显子序列和大小相似，但内含子大小却有很大差别。又如EE0.6序列在W、Z染色体上有一段同源序列，但它们在大部分序列上却存在差异。因此可根据W、Z染色体上基因序列差异来鉴别鸟类的性别[1-2]。与传统方法相比，这种方法准确、快速、方便，对动物伤害小，在鉴定鸟类性别上起重要作用。

基于此，本研究以无锡市动物园饲养的白枕鹤和丹顶鹤为研究对象，分别运用CHD基因鉴定法和EE0.6序列鉴定法，并根据这一结果对白枕鹤、丹顶鹤进行配对，孵化，验证这2种方法在鹤类性别鉴定中的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要材料

样本来自于无锡动物园圈养条件下的白枕鹤(5只，编号B1-B5)、丹顶鹤(3只，编号D1-D3)。利用乙二胺四乙酸(EDTA)或肝素钠方法收集全血样本。

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

按照禽血DNA抽提试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)说明书提取基因组DNA，利用蛋白质核酸分析仪检测基因组DNA的含量和纯度，保存于4℃备用。

1.2.2 引物设计

利用CHD基因内含子两侧保守序列，以及EE0.6序列W、Z染色体上的特异性片断设计特异性引物，引物信息见表1。

1.2.3 PCR扩增与琼脂糖凝胶电泳检测检测

PCR扩增的反应体系为20 μL，含10×Buffer(含Mg)2 μL、dNTPs(2.5 mM)2 μL、上下游引物(10 pmol/μL)各1μL、Taq酶(5U/μL)0.2 μL、模板DNA(100～200 ng/μL)1 μL、灭菌蒸馏水12.8 μL。反应条件为94℃ 5 min；94℃50 s，57℃ 50 s，72℃ 50 s，30个循环；72℃ 10 min。取5 μL PCR扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用Gene Genius凝胶成像仪分析检测扩增结果。

表1 CHD 和EE0.6引物信息

Tab.1 CHD and EE0.6 primer information

1.2.4 白枕鹤、丹顶鹤配对与孵化记录

根据PCR鉴定结果，对白枕鹤、丹顶鹤配对，并记录受精蛋和孵化率。

2 结果

2.1 白枕鹤、丹顶鹤性别鉴定结果

利用引物2550F/2718R对白枕鹤、丹顶鹤性染色体连锁基因—CHD基因在W、Z两个染色体上的同源部分进行扩增，结果见图1。从图1可以看出，B1、B2、B3、B4、D1、D2个体仅能扩增出1条带，即为雄性，而B5、D3个体可扩增出2条带，即为雌性。利用引物组合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ对白枕鹤、丹顶鹤EE0.6序列W、Z两个染色体上的同源部分进行扩增，结果见图2。从图2可以看出，3对引物扩增结果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2个体仅能扩增出1条带，即为雄性，而B5、D3个体可扩增出2条带，即为雌性。从上可以看出，2种PCR鉴定方法结果一致。

图1 CHD基因引物2550F/2718R扩增结果电泳图Fig.1 Electrophoresis diagram of amplification result of CHD gene primer 2550F/2718R 注：B1、B2、B3、B4、B5为白枕鹤；D1、D2、D3为丹顶鹤；M：1 000 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：1 000 bp DNA Ladder Marker

图2 EE0.6序列不同引物组合BW/FZ、CW/FZ、CW/DZ部分扩增结果电泳图Fig.2 Electrophoresis diagram of partial amplification of BW/FZ，CW/FZ and CW/DZ in different combinations of EE0.6 sequences 注：B1、B2、B3、B4、B5为白枕鹤；D1、D2、D3为丹顶鹤；M：500 bp DNA Ladder Marker Note：B1、B2、B3、B4、B5 are white-naped crane；D1、D2、D3 are red-crowned crane；M：500 bp DNA Ladder Marker

2.2 白枕鹤、丹顶鹤配对与孵化结果

根据PCR鉴定结果，对白枕鹤、丹顶鹤配对，并记录产蛋数，受精率和受精蛋孵化率(表2)。

表2 白枕鹤、丹顶鹤配对与孵化结果

Tab.2 Pairing and hatching results of white-naped cranes and red crowned cranes

3 讨论

本研究分别利用CHD基因鉴定法和EE0.6序列鉴定法，对无锡动物园5只白枕鹤和3只丹顶鹤进行性别鉴定。2种鉴定方法的结果一致，B1、B2、B3、B4、D1、D2个体为雄性，B5、D3个体为雌性。CHD基因鉴定法和EE0.6序列鉴定法已先后在丹顶鹤、蓑羽鹤(Anthropoidesvirgo)、灰鹤(Grusgrus)、白鹤(Grusleucogeranus)、东方白鹳(Ciconiaboyciana)、黑冠鹤(Balearicapavonina)等珍稀鹤类扩增出不同的片段[3-5]，刘鑫等[6]曾尝试利用EE0.6序列对白枕鹤的性别进行鉴定，张红霞[7]也曾利用CHD基因引物2550F/2718R和EE0.6序列鉴别了白枕鹤、蓑羽鹤、黑冠鹤、丹顶鹤和灰鹤性别，尽管这些方法能对性别作出判断，有利于珍稀鹤类的繁殖，但是真正在生产中应用案例还很少见。本研究为了验证该方法的实际可操作性，根据PCR鉴定结果对白枕鹤、丹顶鹤进行配对，结果均成功孵化出后代，表明该PCR鉴定结果可靠。与传统鉴定性别相比，该方法采样量小，取样容易，对鹤类应激反应也不大，相对安全；利用稳定遗传的基因组DNA进行PCR扩增应用来鉴定性别，结果更可靠；鉴定不受年龄的限制，从刚出生到成年个体均可通过PCR鉴定性别；操作简便、周期短，也易推广。研究结果可为进入繁殖期鹤类进行配对提供了依据，避免了同性配对，从而提高繁殖效率，有效地保护物种。

[1] 陈武，谢淑敏，谢高基，等.PCR技术在鸟类性别鉴定上的应用[J].中国兽医科学，2006，36(6)：485-488.

[2] 包文斌，胡飞，徐琪，等.鸟类性别鉴定的分子生物学方法[J].中国畜牧兽医，2007，34(10)：33-36.

[3] 田秀华，刘铸，何相宝，等.7种鹤形目鸟类性别的分子鉴定[J].动物学杂志，2006，41(5)：62-67.

[4] 刘铸，田秀华，白素英.一种准确简便的东方白鹤性别分子鉴定方法[J].野生动物，2006，27(3)：50-53.

[5] Itoh Y，Suzuki M，Ogawa A，et al.Identification of the sex of a wide range of Carinatae birds by PCR using primer sets selected from chicken EE0.6 and its related sequences[J].Journal of Heredity，2001，92(4)：315-321.

[6] 刘鑫，张红霞，包文斌，等.白枕鹤性别的分子鉴定方法[J].扬州大学学报：农业与生命科学版，2009，30(1)：42-44.

[7] 张红霞.鹤性别鉴定及线粒体遗传多样性与鹤系统发育分析[D].扬州：扬州大学，2008.