雄性北树鼩对不同繁殖期雌性尿液的气味辨别

侯东敏 王政昆 叶芳艳 朱万龙

(云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室，云南师范大学生命科学学院，昆明，650500)

在哺乳动物的繁殖行为中，尿液中化学信号发挥着极为重要的作用。与正常雄性小家鼠(Musmusculus)相比，免疫缺陷使雄鼠的某些性信息素成分(如E-βFarnesene，E，E-αFarnesene，1-hexadecanol)含量普遍降低，雄鼠尿液对雌鼠的吸引力显著降低[1-2]；这说明小家鼠可以通过异性的尿液气味来判断其免疫能力，从而选择高质量的配偶，以增加后代的适合度。雄性小鼠尿液中含有大量的气味分子使雌性小鼠发情，如6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone能够诱导雌鼠来交配[1]。根田鼠(Microtusoeconomus)哺乳和非哺乳期雌性尿液的化学组成成分存在显著差异，通过行为学研究发现，雄性能够辨别这种差异，在选择配偶时更偏向于处于哺乳期的雌性[3]。尿液挥发性成分的组成影响动物的行为反应[4-7]。

有研究表明，雌性动物个体尿液中化学信号与性吸引力有关[8]，雌性根田鼠在不同生理时期的尿液中的信息素成分会产生变化，哺乳期尿液中特有物质为2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物质为2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，这3种化合物能引发雄性个体对处于哺乳和非哺乳的雌性个体尿气味的行为差异，从而影响雄性对配偶的选择[7]。雌性小家鼠处于动情期时，个体尿液中含有特异的信号物质1-Iodo-2-methylundecane，能雄性个体动情[8]。可见，动物的尿液含有不同的挥发性化合物，刺激它们的性行为，从而影响配偶选择和繁殖成功率。

北树鼩(Tupaiabelangeri)亦称中缅树鼩，属攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)，分布于南亚、东南亚以及中国南部和西南部地区，为东洋界特有的昼行性小型哺乳动物。北树鼩为杂食性动物，偏爱动物性食物，也喜甜食。北树鼩在自然条件下采取一雄一雌或一雄多雌的繁殖方式。因北树鼩体形小易控制、管理方便、容易饲养、成本低、繁殖快，且其在生物学特征、生理生化、新陈代谢以及基因组等方面与人类较为相近，故被认为是一种具有潜在应用价值的新型实验模式动物，现已广泛应用于多种疾病的研究。因野外繁殖率较高，但实验室繁殖率较低，因此极大地阻碍了北树鼩实验动物模型化进程。根据本研究组之前的研究结果，我们假设雄性北树鼩能够辨别雌性北树鼩不同生理状态(发情期、怀孕期和哺乳期)的尿液，并推测雌性北树鼩不同生理状态(发情期、怀孕期和哺乳期)的挥发性成分组成存在差异，找出尿液中信息素，为研究尿液成分在北树鼩配偶选择中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物来源

本研究的实验动物，北树鼩捕自昆明禄劝县灌丛(N25°26′～26°22′；E102°13′～102°575′)，海拔1 679 m。动物捕回后于云南师范大学生命科学学院实验动物房(昆明)单笼室温饲养，饲养笼规格为：120 mm×200 mm×300 mm，室温控制在(25±1)℃，光周期12L∶12D，供以充足的饲料。用于尿液成分分析、气味辨别的实验。实验室驯化1个月后，选择60只北树鼩为实验对象(♀30和♂30)，一雌一雄配对，有20只雌性北树鼩怀孕。其中10只作为怀孕期(交配后20 d)的对象，10只作为哺乳期的对象，此外选取了12只发情期的雌性北树鼩。实验开始前选取了6只雄性北树鼩作为气味辨别的研究对象。

发情期的判定标准为：雌性生殖孔正常开放，食量下降，焦躁不安，活动量明显增加，喜欢做“后空翻”运动，有些母树鼩甚至会主动追爬公树鼩[9]，处于发情周期、非孕期和非哺乳期。为保证实验的准确性，在进行行为学实验前，随机选择3只发情期雄性个体为被试对象，进行左右偏好测试。安装好Y-型迷宫，将雄北树鼩分别作为被试动物放于适应箱内，刺激源为空箱，发现动物没有左右偏好，再进行本实验。刺激源为雌性北树鼩不同繁殖期(发情期、怀孕期(交配后20 d)、哺乳期)的尿液，实验时间为每天9：00～16：00，同时收集不同繁殖期雌性尿液用于GS-MS分析尿液挥发性成分。

1.2 气味辨别

Y-型迷宫底面及两侧面以镀锡铁皮(厚16 mm)制作，顶面端面由透明亚克力板制作，由适应箱、选择臂及刺激源箱组成，行为观察室内装有15 W的白炽灯照明及实时监测红外相机。由适应箱、选择臂及刺激源箱组成，行为观察室内装有15 W的白炽灯照明及实时监测红外相机。

实验时，依次安置好刺激源、被试鼠、有机玻璃盖，随后开启鼓风机电源，在2个选择臂内形成气流速度约1 m/s的气流；被试动物适应15～20 min后，打开适应箱的前门，正式观察记录10 min；观察者站在适应箱一端，通过迷宫上方透过有机玻璃盖观察鼠的活动，并用秒表记录被试鼠分别花费在2个观察臂内的时间；在同一组实验中，同一刺激源于左右刺激源内各放置1次，来保证刺激放置的随机性。每次测试持续10 min，用秒表记录被试动物在每个迷宫臂内的时间。每次实验结束后，用清水和75%酒精清洗迷宫内侧，并用热风吹干，待用于下一次测试。刺激源为发情期和怀孕期组合，哺乳期和怀孕期组合，哺乳和发情组合。实验后，用清水和75% 酒精将迷宫进行擦洗，以待下次实验使用。

1.3 尿液样品的采集与处理

分别收集发情期、怀孕期、哺乳期雌性个体的尿液，取样时间为9：00和17：00。采样采用12 mL样品瓶(宁波哈迈，HM-1266A，棕色螺纹样品瓶)，每瓶收集鲜尿液5～10 mL。动物装入代谢笼内，将三角漏斗擦拭干净并垫入一层薄薄的脱脂棉，然后将新的顶空分析样品瓶拴在漏斗接口处，后将代谢笼放在漏斗上待收集鲜尿液；待收集到尿液后(若被粪便或食物残渣等污染的尿液应丢弃)，将瓶子取下并立即盖好并拧紧样品瓶盖，样品瓶盖是具带聚四氟乙烯(PTFE)涂层的隔垫，并将聚四氟乙烯涂层朝下，避免可能产生的污染；取下代谢笼，将三角漏斗里面的粪便和余下的尿液处理干净，换一层新棉花重复以上步骤即可；样品瓶上标记所采个体编号，并于记录本上详细记录每个编号所对应动物的呼名、性别、年龄、发情阶段、采样日期及时间等信息。每只个体每次采样2份，收集好的尿液立刻密封并迅速置于-20℃冰箱贮存(确定好样品后使用生料带(聚四氟乙烯，PTFE)对样品瓶进行密封，保存时尽量保持样品处于直立状态)。尿液样品采集工作在1周左右完成。之后将尿液样品送至苏州帕糯米克生物科技有限公司(江苏省苏州市)进行测定。

取5 mL的样品置于20 mL顶空瓶中，压紧瓶盖，于55℃水浴锅中水浴40 min，继而使固相微萃取头顶空吸附20 min，然后进样，利用HS-SPME萃取头在250℃下不分流解吸10 min后，收回萃取头并拔出萃取针，在使用萃取针前在250℃老化10 min，冷却到室温后依次用甲醇、乙醚、正己烷、去离子水清洗，再用于GC-MS分析。

1.4 尿液挥发性成分的GC-MS测定

利用气相色谱和质谱联用GS-MS测定北树鼩的尿液成分的挥发性化学组成。GC-MS色谱条件：色谱柱为DB-5毛细管柱子(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为He，流速1 mL/min，不分流；进样温度为240℃，柱箱温度为50℃；升温程序为起始温度为50℃，保持2 min，以4℃/min，升至240℃，保持5 min。质谱条件：EI电离源，能量70 eV，倍增电压1 400 V；离子源温度200℃，接口温度250℃，四级杆温度150℃，扫描范围40～450 m/z，间隔0.3 s。然后将采集到的质谱图利用计算机谱库进行检索，鉴定样品中的挥发性成分。检测出的物质通过NIST(National Institute of Standards and Technology)质谱库进行检索，再结合物质保留时间来对物质进行推定。

1.5 数据处理

采用SPSS13.0软件包进行实验数据的统计分析。数据经过正态分布和方差齐次性检验，符合参数检验条件。中缅树鼩在Y型迷宫中行为学统计分析均使用独立样本t检验(Independent-SamplesTTest)。数值均以平均值±标准误(Mean±SE)表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 雄性北树鼩对雌性北树鼩不同繁殖期的尿液响应

使用处于发情期或哺乳期雌性北树鼩尿液和怀孕期北树鼩的尿液作为气味刺激源时，雄性北树鼩均极显著偏好发情期(t=-6.13，P<0.01)或哺乳期(t=-3.70，P<0.01)雌性北树鼩尿液的气味；用处于发情期和哺乳期雌性北树鼩的尿液作为气味刺激源时，被试雄性北树鼩没有表现出(t=-0.48，P>0.05，表1)气味偏好。

表1 Y型迷宫中雄性北树鼩对雌性不同繁殖期尿液气味的辨别

Tab.1 Preference of male Tupaia belangeri to femaleurine odour from different period in Y-maze

注：数值为平均值±标准误差，ns：差异不显著(P> 0.05)，P<0.01，差异极显著

Note：Data are means±SE，ns：non-significant(P>0.05)，P<0.01 indicates very significant difference between two groups

2.2 发情期、怀孕期和哺乳期雌性尿液挥发性成分

经GC-MS分析发情期、怀孕期、哺乳期北树鼩尿液的挥发性成分组成见表2。发情期雌性尿液挥发性成分有59种，其中醇19种，酮8种，醛6种，烯烃3种等。怀孕期雌性尿液挥发性成分有83种，其中醇23种，酮7种，醛3种，酚类3种，杂环类4种等。哺乳期雌性尿液挥发性成分有69种，其中醇22种，酮11种，醛2种，酚类3种，杂环类4种等。发情期、怀孕期、哺乳期雌性尿液挥发性成分的结果表明，3种不同生理时期的雌性尿液中的挥发性成分大部分相同，都是醇类和酮类化合物为主体等。

在3种不同生理时期的尿液中也有表达特异性的挥发性成分：与怀孕期和哺乳期相比，发情期雌性尿液中特有的挥发性成分为Butandl，3-methyl-、Hexadecane、1，3，6，10-Dodecatetraene、3，7，11-trimethyl-、(Z，E)-、Cyclooctane；与发情期和哺乳期相比，怀孕期雌性尿液中特有的挥发性成分为Acetone、Disulfide、dimethyl、2，3-Hexanedione、(R)-(-)-2-Pentanol、2，4-Dithiapentane、2-Buten-1-ol、3-methyl-、2-Nonanol、Benzaldehyde、2-methyl-、6-Octen-1-ol、7-methyl-3-methylene-、2，6-Octadien-1-ol、3，7-dimethyl-、(Z)-、Cyclohexadecanone、Dibutyl phthalate；与发情期和怀孕期相比，哺乳期雌性尿液中特有的挥发性成分为o-Xylene、2，5-Octanedione、α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、4-(3，4-Methylenedioxyphenyl)-2-butanone、3-Cydohexene-1-d、4-methyl-1-(1-methylethyl)-、(R)-、Cyclohexanone、2-methyl-5-(1-methylethenyl)-、Benzoic acid、2-ethylhexyl ester、2-6-10-Dodecatrien-1-ol、3，7，11-trimethyl-。

表2 发情期、怀孕期、哺乳期北树鼩尿液的挥发性成分组成

Tab.2 Compounds identified in urine of the T.Belangeri in estrus，pregnancy and lactation

续表2

续表2

注：+表示物质的存在

Note：+Material existence

3 讨论

3.1 雄性北树鼩对不同繁殖期雌性尿液的辨别

哺乳动物的尿液包含着生殖状态的信息[10-14]，例如，根田鼠哺乳和非哺乳期雌性尿液的化学成分存在显著差异，通过行为学研究发现，雄性能够辨别这种差异，在选择配偶时更偏向于处于哺乳期的雌性[3]，动情期牛的尿液对雄牛的性吸引作用明显[8]。在我们的研究同样发现，雄性北树鼩能依据尿液气味辨别发情期、怀孕期、哺乳期的雌性，这说明尿液能编码雌性北树鼩的繁殖状态信息。

在繁殖季节，雌雄个体会交流彼此的动情状态和排卵信息，这是动物生存和繁衍的重要保障，因此，大多数雌性哺乳动物随着生理周期的变化产生不同的气味，向雄性传递繁殖状态的信息。尿液是哺乳动物中最重要的气味源之一，处于不同生理周期的动物，气味的组成成分也随之变化[15]。大量的研究表明，很多啮齿类动物都有自己的发情周期，与非发情雌性尿液气味相比，雄性更偏好发情期间雌性尿液气味[16]。同样地，与其他生理周期相比，雄性更偏好动情期雌性个体气味[15]。

以上研究都表明不同生理时期雌性个体尿液中信息素成分存在差异。我们的行为学研究也表明，雄性北树鼩对发情期、怀孕期和哺乳雌性个体尿气味的行为响应不同，可见这3个生理时期的尿液信息素成分必然有所不同，因此我们用GC-MS技术分析了发情期、怀孕期和哺乳雌性个体尿气味的挥发性成分，试图找出引起雄性个体行为差异的信息素。

3.2 不同繁殖期雌性尿液挥发性成分的比较

GC-MS分析结果表明，3种不同生理时期雌性个体尿液中可挥发性成分大部分是相同，主要是醇类和酮类化合物，同时含有一定量的支链烷烃和杂环化合物。本研究发现，尿液中挥发性成分中醇类化合物含量最多，而烷烃和酚类等其他化合物含量较少，这3种生理时期雌性的尿液中都含有大量醇类化合物，因此推断此类化合物可能是尿液中的机体代谢终产物。在其他的一些哺乳动物尿液中也发现了身体储备物质的新陈代谢产物—酮类化合物，同样在3种来源的非繁殖期北树鼩尿液也存在。该结果表明这些储备物质的代谢途径受系统发育控制。

研究表明哺乳期与非哺乳期雌性尿液中部分挥发性化学成分不同。动情期尿液特有Butanal、3-methyl-、1，3，6，10-Dodecatetraene、3，7，11-trimethyl-、(Z，E)-、Cyclooctane；怀孕期尿液特有物质Acetone、Disulfide、dimethyl、(R)-(-)-2-Pentanol、2，4-Dithiapentane、3-methyl-、2-Nonanol、Benzaldehyde、2-methyl-、6-Octen-1-ol、7-methyl-3-methylene-、2，6-Octadien-1-ol、3，7-dimethyl-、(Z)-、Cyclohexadecanone、Dibutyl phthalate；哺乳期雌性尿液中特有的挥发性成分为O-Xylene、2，5-Octanedione、α-Methyl-α-[4-methyl-3-pentenyl]oxiranemethanol、4-(3，4-Meth-ylenedioxyphenyl)-2-butanone、3-Cyclohexcn-1-op、4-methyl-1-(1-methylethyl)-、(R)-、Cyclohexanone，2-methyl-5-(1-methylethenyl)-、Benzoic acid，2-ethylhexyl ester。Benzoic acid，2-ethylhexyl ester、-2，6，10-Dodecatrien-1-ol、3，7，11-trimetlyl-具有驱赶其他个体的功能。然而这些特有化合物在研究尿样中出现的频率和含量都很低，可能是由于实验动物的个体差异所致。发情期尿液特有物质Hexadecane；怀孕期特有物质2，3-Hexanedione、2-Buten-1-ol，3-methyl-；哺乳期特有物质Cyclohexanone、2-methyl-5-(1-methylethenyl)-在研究的尿样中出现频率和含量都很高，另外，在其他哺乳动物的研究中以往的研究表明烷烃类化合物在动物性别吸引中具有重要作用[17]，因此这4种物质可能是性信息素，能引起雄性中缅树鼩对3种不同时期尿液的行为差异。体内荷尔蒙有规律的变化能引起动物的生理周期的变化，因此不同生理时期体内荷尔蒙能引起3种时期尿液存在挥发性成分的变化。

在哺乳动物中，雌性个体通过信息素向雄性个体传递繁殖信息。雌性根田鼠在不同生理时期尿液中的信息素成分会发生改变，哺乳期尿液中特有物质为2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物质为2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，这3种化合物引起雄性个体对哺乳和非哺乳雌性尿气味的行为差异，对雄性个体吸引强度不同，从而影响雄性的配偶选择[7]。雌性小家鼠处于动情期时，尿液含有特异的信号物质为1-Iodo-2-methylundecane，能雄性个体动情[8]。1-iodoundecane是动情期牛的尿液中特有的信号物质，能显著吸引公牛[17]。在我们的研究中，3种生理时期尿液都特有物质。综上所述，不同生理时期动物的尿液成分会发生变化，信息素成分会发生改变，对雄性个体吸引强度不同，从而影响雄性的配偶选择。本实验室明确雌性北树鼩不同生理期尿液成分，筛选出候选性信息素成分，在后续研究中，我们会改变不同生理时期尿液的成分验证其功能。

尿液中的化学信号在哺乳动物繁殖行为发挥重要作用。与正常雄性小家鼠相比，免疫缺陷使雄鼠的某些性信息素成分(如E-β Farnesene，E，E-α-Farnesene，1-hexadecanol)含量普遍降低，雄鼠尿液对雌鼠的吸引力显著降低[2]；这说明小鼠可以借助异性尿液气味评估其免疫能力，选择高质量的配偶，提高后代的适合度。雄性小鼠尿液中含有大量使雌性小鼠发情的气味分子，如6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone能够诱导雌鼠来交配[1]。根田鼠哺乳和非哺乳期雌性尿液的化学成分存在显著差异，通过行为学研究发现，雄性能够辨别这种差异，在配偶选择中更偏好于哺乳期雌性[7]。

雌性个体不同生理时期尿液中的信息素成分会发生改变，根田鼠哺乳期尿液中特有物质为2-iodide octane，非哺乳期尿液特有物质为2-iodide hexane、2，6，10-three methyl fourteen alkyl，对雄性个体吸引强度不同，这3种化合物引起雄性个体对哺乳和非哺乳雌性尿气味的行为差异，从而影响雄性的配偶选择[7]。雌性小家鼠处于动情期时，尿液中含有个体尿液中特异的信号物质1-Iodo-2-methylundecane，能雄性个体动情[8]。

综上所述，在我们的研究中，如上述的根田鼠和雌性小家鼠一样，北树鼩能够依据尿液辨别不同繁殖期的雌性树鼩，尿液在北树鼩的繁殖中发挥着重要作用。同时，不同繁殖期的雌性树鼩尿液的化学成分存在较大差异，各繁殖期的特有物质可能是引起雄性树鼩不同的行为反应。本章实验旨在明确雌性北树鼩不同生理状态(发情期、怀孕期和哺乳期)尿液的挥发性成分组成，发情期尿液特有物质Hexadecane；怀孕期特有物质2，3-Hexanedione、2-Buten-1-ol，3-methyl-；哺乳期特有物质Cyclohexanone，2-methyl-5-(1-methylethenyl)-，这些物质可能是雌性信息素。为研究尿液成分在北树鼩配偶选择中的作用奠定基础，筛选出候选雌性信息素，最终为实现北树鼩的规模化养殖和管理提供一定的科学依据。

[1] Novotny M V，Jemiolo B，Wiesler D，et al.A unique urinary constituent，6-hydroxy-6-methyl-3-heptanone，is a pheromone that accelerates puberty in female mice[J].Chemistry & Biology，1999，6(6)：377-383.

[2] Zhang Jianxu，Rao Xiaoping，Sun Lixing，et al.Putative chemical signals about sex，lndividuality，and genetic background in the preputial gland and urine of the house mouse(Musmusculus)[J].Chemical Senses，2007，32(3)：293-303.

[3] Ma Weidong，Miao Zhongshan，Novotny M V.Induction of estrus in grouped female mice(Musdomesticus)by synthetic analogues of preputial gland constituents[J].Chemical Senses，1999，24(3)：289-293.

[4] Mulungu L S，Sabuni C A，Ngowo V，et al.Domestic cat(Felissilvestriscatus)urine odour as a potential rodent management strategy[J].Huria：Journal of the Open University of Tanzania，2016，22(1)：132-139.

[5] Mucignat-Caretta C，Redaelli M，Orsetti A，et al.Urinary volatile molecules vary in males of the 2 European subspecies of the house mouse and their hybrids[J].Chemical Senses，2010，35(8)：647-654.

[6] Yu Honghao，Zhao Xinquan，Yue Pengpeng，et al.Chemical communication in mammal population：urinary olfactory chemosignals in lactating female root voles(Microtusoeconomuspallas)[J].Polish Journal of Ecology，2010，58(1)：153-165.

[7] Gilfillan G D，Vitale J D，McNutt J W，et al.Spontaneous discrimination of urine odours in wild African lions，Pantheraleo[J].Animal Behaviour，2017，126(2)：177-185.

[8] Achiraman S，Archunan G.1-Iodo-2methylundecane，a putative estrus-specific urinary chemo-signal of female mouse(Musmusculus)[J].Theriogenology，2006，66(8)：1913-1920.

[9] 邹如金，季维智，沙临力，等.树鼩(Tupaiabelangerichinensis)的繁殖[J].动物学研究，1987，8(3)：231-237.

[10] Kwak J，Jackson M，Faranda A，et al.On the persistence of mouse urine odour to human observers：a review[J].Flavour and Fragrance Journal，2016，31(4)：267-282.

[11] Khrisna D G.Al-Mamari A H J，Al-Hinai A H A.Identification of some physical，chemical，hematological，pathological and biochemical constituents of urine by macroscopic analysis and microscopic examination[J].World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences，2015，4(5)：865-871.

[12] Starkenmann C，Niclass Y，Cayeux I，et al.Odorant volatile sulfur compounds in cat urine：occurrence of(+/-)-3，7-dimethyloct-3-sulfanyl-6-en-1-ol and its cysteine conjugate precursor[J].Flavour and Fragrance Journal，2015，30(1)：91-100.

[13] Apfelbach R，Soini H A，Vasilieva N Y，et al.Behavioral responses of predator-naive dwarf hamsters(Phodopuscampbelli)to odor cues of the European ferret fed with different prey species[J].Physiology & Behavior，2015，146(1)：57-66.

[14] Osada K，Tashiro T，Mori K，et al.The identification of attractive volatiles in aged male mouse urine[J].Chemical Senses，2008，33(9)：815-823.

[15] Rajanarayanan S，Archunan G.Occurrence of flehmen in male buffaloes(Bubalusbubalis)with special reference to estrus[J].Theriogenology，2004，61(5)：861-866.

[16] Michael R P，Keverne E B，Bonsall R W.Pheromones：isolation of male sex attractants from a female primate[J].Science，1971，172(3986)：964-966.

[17] Kumar K R，Archunan G，Jeyaraman R，et al.Chemical characterization of bovine urine with special reference to oestrus[J].Veterinary Research Communications，2000，24(7)：445-454.