‘富平尖柿’炭疽病防治药剂筛选

邓全恩，丁向阳，徐建强，李建安，谷战英

（1. 中南林业科技大学 a.经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；b.经济林培育与保护教育部重点实验室，湖南 长沙 410004； 2.河南省林业科学研究院，河南 郑州 450008；3.河南科技大学，河南 洛阳 471003）

柿Diospyros kaki原产于我国秦岭山区，是我国主要的木本粮食树种，一年种植多年受益，被称为“铁杆庄稼”。柿果味美多汁，且因其富含维生素，胡萝卜素，矿物质钙、铁、磷等多种营养物质，而具有多重药用价值，不但可供鲜食还可加工成柿饼，是深受人民喜爱的传统水果。柿树适生性强，目前已在中国、日本、韩国、新西兰等多个国家广泛栽培种植[1-2]。陕西省是我国柿主产区之一，栽培面积约23 500 hm2，产量居全国第4[3]。‘富平尖柿’是其代表性品种，已有2000多年的栽培历史。目前富平县已建成尖柿生产基地6 000 hm2，年产鲜柿4×107kg，加工柿饼8×106kg。富平柿饼因其超高品质，享誉海内外，市场一直处于供不应求的状态，为当地农民带来了巨大的经济效益，加之发展柿产业符合国家的生态保护[4]和发展木本粮油[5]的相关政策，富平县新造柿园数量逐年增加。

炭疽病是柿树上常见病害，严重影响柿树长势、柿果的产量和品质，该病病原菌为柿树炭疽菌Colletotrichum horii[6]。该病在不同柿品种上症状表现不尽相同，在‘富平尖柿’上炭疽病主要侵染幼树的新梢和新生叶片，老树较少发病，新梢染病后出现黑色小圆斑，病斑渐扩大，呈长椭圆形，褐色，凹陷，纵裂，长1～5 cm，病部木质腐朽，易折断。柿叶发病，先自叶脉、叶柄变黄，后变黑，叶片病斑呈不规则形。高温多雨是该病害发生和流行的决定因素，生产上主要通过加强栽培管理措施、提高树势，铲除病毒来源、清除病苗，同时结合药剂保护等措施进行综合防治[7]，其中化学药剂防治是最为有效且关键的措施，但该环节对使用的药剂要求较高，使用不当的话，不但效果不好还可能造成环境污染、人畜中毒等后果。由于该病的发生，严重限制了‘富平尖柿’新造林的成活率，因此寻找有效的防治药剂是‘富平尖柿’产业发展亟待解决的问题。炭疽病在多种果树、农作物上均有发生和研究报道[8-12]，柿炭疽病的研究近年来才开始，主要集中在部分品种炭疽病菌的分离鉴定和分子序列分析[13-15]、侵染过程、发生发展规律及综合防治技术[16-17]等发面，对于柿炭疽病防治药剂的筛选还处于初步研究阶段[18-19]，针对单一柿品种进行的大范围药剂筛选研究目前还没有。

1 材料与方法

1.1 富平尖柿炭疽病菌的分离

（1）试剂：PSA或PDA培养基，75%酒精，2.5%～5%次氯酸钠溶液、5%乳酸等；（2）柿炭疽病标本来源：2015年7月份采自与陕西富平曹村镇的炭疽病样本，包括感病枝条、叶片；（3）分离方法：切取小块病组织（病健交界处），经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。包含如下步骤：1）取灭过菌的培养皿5个，依次倒入75%酒精、5%次氯酸钠和三皿无菌水；2）取病组织放入酒精中2～3 s，捞出放入次氯酸钠中灭菌2～3 min（枝条组织块大且粗糙，需灭菌3～5 min，以防污染）；3）无菌水依次冲洗三次；4）用灭过菌的吸水纸吸干水分；5）接入平板内，培养。（4）菌株保存：采用2 mL离心管保存于4～8℃冰箱。

1.2 常见杀菌剂对‘富平尖柿’炭疽病菌的毒力测定

选定苯并咪唑类、三唑类、二甲酰亚胺类等10类21种杀菌剂进行药剂筛选，主要考虑药剂 的MIC值 和EC50值。MIC（Minimal inhibition concentration）又叫最小抑菌浓度, 是测定抗菌药物抗菌活性大小的一个指标，指培养细菌18～24 h后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度；EC50（concentration for 50% of maximal effect）又叫半最大效应浓度，是指能引起50%个体有效的浓度。两指标计算涉及公式为：抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径/(对照菌落直径-5)×100%。

（1）MIC值测定方法为：将供试菌株接种在含有一定浓度梯度（见表1）杀菌剂的PSA平板上，不含药的PSA平板为对照，每皿2个菌株，每处理3次重复，25℃培养3 d后，采用十字交叉法测量各处理的菌落直径，求平均值后，利用抑制率公式计算；

（2）EC50值测定方法：使用菌丝生长速率法进行测定，采用抑制率公式求出各个药剂浓度对菌丝生长抑制率，所得数据经Finney概率分析后用DPS统计软件求出毒力回归方程式及EC50。实验步骤包括：①配置杀菌剂母液。将备试原药用丙酮溶解， 配制成10 g/L的母液备用。②炭疽菌株进行活化。把炭疽的菌丝接种于培养皿的PSA培养基平面中央，培养4 d左右待用。③制备带毒培养基。依据前期各杀菌剂对柿炭疽病菌MIC值的测定结果，设置系列浓度梯度（见表1），根据浓度梯度加入一定量的杀菌剂母液，制备系列浓度的带毒培养基。 ④炭疽病菌接种。将活化后的炭疽病菌用打孔器在菌落边缘打出直径为0.5 cm的菌饼，然后接种于含药剂系列浓度的PSA培养基上。⑤病菌抑制效果观测。炭疽病菌于25 ℃培养箱中培养6 d左右，观察菌丝生长状况，测量菌落直径，算出抑制率。以不加药剂的PSA平板为空白对照，每个药剂浓度3次重复。

表1 柿不同部位炭疽病原菌分离效果Table 1 Isolation effect of anthrax pathogen in different parts of persimmon

1.3 田间试验

（1）试验地情况 试验点位于陕西省富平县曹村乡一3年生富平尖柿园，株行距为 3 m×4 m，柿园地形为平地，黄壤，pH值7.1，肥力中等，管理水平中等，整个园区发病情况基本一致.

（2）试验方法 结合已经得到的室内防治药剂筛选结果，选择其中效果较好苯菌灵、甲基托布津、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、咯菌腈、戊唑醇6 种进行柿炭疽病室外防治药剂的筛选试验，设 6个药剂处理和1个清水对照，每处理 3次重复，共 21个小区，每小区 3株柿树，每个处理9棵树喷1/3雾器药液（ 22 kg）。施药时间为2015年8 月2日、9月3日、10月5日，施药时间为下午4点左右。皆为晴天或多云，喷药后3 d 内均未下雨。

（3）调查方法 由于该病主要发生富平尖柿的幼嫩的纸条上，所以以枝条发生情况来表示不同药剂的防治效果，枝条病斑的严重程度划分以病斑的面积计算，公式为：病斑面积=病斑长×病斑宽，以最后一次喷完药第20天调查不同处理的防治效果。防治效果=（对照病斑面积-处理病斑面积）/对照病斑面积×100%。

1.4 数据处理

应用Microsoft Excel 2007、SPSS19.0和V12.01软件对数据进行处理和制表、制图等。

2 结果与分析

2.1 炭疽病病原菌分离结果

连续3年从发病叶脉中分离病原菌成功率均较高，可见染病柿树叶脉是分离炭疽病菌的最佳材料，但缺点是保存期短；病害枝条分离病原菌成功率不高，且易受杂菌污染，其可能原因是枝条较硬，材料不易处理，但优点是保存时间长，故在样本有限的情况下可先分离叶脉，后分离枝条。分离过程中发现，直接挑取黄色的分生孢子角，放入加过乳酸的PSA上，分离到了1个菌株，所以对于有分生孢子角的材料，可以直接挑取分生孢子角来分离，而且此种方法操作非常简便，不需要消毒处理及冲洗的步骤，操作迅速，需时短，但此法要求必须具有典型分生孢子角的材料。

2.2 室内不同药剂对‘富平尖柿’炭疽病菌的抑制作用

由表2可看出三唑酮的浓度为10 μg/mL时抑制率仅为31.48%，故可推算MIC大于等于10 μg/mL，丙环唑浓度为5 μg/mL时抑制率已经达到了96.3%，10 μg/mL和5 μg/mL差别不大，故可推算出5 μg/mL是丙环唑对炭疽病菌有效的最小浓度，根据上表中两种药剂对‘富平尖柿’炭疽病菌MIC值得计算方法，计算供试的21种药剂的MIC值，结果见表2。

表2 2种三唑类药剂对‘富平尖柿’炭疽病菌的抑制作用Table 2 Inhibition effects of two fungicides on pathogens of anthracnose of ‘FupingJianshi’

按照表4中苯醚甲环唑计算方法得出每种药剂的相关数据，经Finney概率分析后用DPS统计软件求出供试药剂的毒力回归方程式及EC50值，见表5。

由表3、表5可以看出供试的10类21种杀菌剂中苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类（三唑类）、苯吡咯类三类杀菌剂对‘富平尖柿’的抑制效果较好。在测定MIC值时考虑了有机磷类中的甲基立枯磷和保护性杀菌剂代森锰锌和福美双，但抑制效果不理想，此外有机磷农药一般用量大、持效期短（7～10 d），易产生抗药性，特别容易诱发人畜中毒事故，故测定EC50值时没有考虑有机磷类，保护性杀菌剂也只测定了百菌清，且效果极不理想。

表3 供试药剂对‘富平尖柿’炭疽病菌的MIC值Table 3 MIC value of fungicides on pathogens of anthracnose of ‘FupingJianshi’

表4 苯醚甲环唑对柿炭疽病菌菌丝生长的抑制Table 4 Inhibition effects of fungicides on pathogens of anthracnose of ‘FupingJianshi’

2.3 田间试验

由表6可以看出，3次喷药后20 d后调查，与清水对照相比，选出的杀菌剂对富平尖柿炭疽病的防治效果均较为显著，其中苯菌灵、噻呋酰胺和咯菌腈防治效果较好，适宜大规模推广使用。

3 结论与讨论

苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类（三唑类）、苯吡咯类三类杀菌剂对‘富平尖柿’的抑制效果较好，其中噻菌灵、多菌灵、苯菌灵、甲基托布津、苯醚甲环唑、戊唑醇、丙环唑、咯菌腈8种药剂的MIC值均在10以下，EC50值在0.011 2～0.520 3的范围内，说明这8种药剂在实验室水平来讲对柿炭疽病有较好的防治效果，在后续的田间试验筛选出苯菌灵、甲基托布津、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、咯菌腈、戊唑醇6 种药剂进行试验，结果显示苯菌灵、噻呋酰胺、咯菌腈防治效果加好，适宜大规模推广。

表5 供试药剂对‘富平尖柿’炭疽病菌菌丝生长的毒力Table 5 Inhibition effects of fungicides on pathogens of anthracnose of ‘FupingJianshi’

表6 不同药剂的田间防治效果Table 6 Inhibition effects of different fungicides on anthracnose of persimmon in field treatment

炭疽病在多种果树、农作物上均有发生，所以市场上炭疽病的防治药剂种类繁杂、效果不一、安全性不确定，因此进行药剂的筛选显得尤为重要。本实验选择了10类22种药剂，基本上覆盖了近年来市场上病害防治的常用药剂，是一次范围较为广泛的药剂筛选，结果显示苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类（三唑类）、苯吡咯类三类三类药剂效果较好，它们有的品种已应用在柿炭疽病的防治上，有的则正在作为复配剂进行新型药剂开发。但由于三唑类杀菌剂的作用机理是抑制病原菌体内甾醇的脱甲基化过程，作用位点相对单一，因此存在较高的抗药性风险[20]，且同类品种间有正交互抗性，应注意与其他类型杀菌剂混用或轮换使用。琥珀酸脱氢酶抑制剂类（SDHIs）及甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂（QoIs）对柿炭疽病菌毒力差异较大，需做进一步的探索。

本文首次大范围试验了不同类别杀菌剂对柿炭疽病病菌的室内和田间防治效果，为制定针对‘富平尖柿’炭疽病较为有效防治技术打下了基础。但由于试验点较远，原计划每次喷药后进行的效果调查，统一到最后一次喷药的20天后调查，虽然能说明不同药剂的防治效果，但不能显示出不同药剂的起效速度和药效持续时间等，且本次试验未考虑不同类型药剂之间的复合使用效果。后续工作设计实验方案可以考虑完善调查方法、药剂的复配等，弥补本次饰演的不足。通过不同药剂的配合使用筛选出效果较好的药剂组合，可为复配新型药剂做基础研究。也可考虑发病前防治和发病后防治的效果差异来比较不同药剂的防治效果和预防效果，进而探讨不同药剂的最佳喷药时期[21]。此外，还需对各种杀菌剂进行综合比较，诸如对植物生长的影响、对环境的影响、成本分析等，力求经济合理地施用高效低毒杀菌剂。

[1]Yonemori K, Honsho S, Kanzaki S. Sequence analyses of the ITS regions and the matK gene for determining phylogenetic relationships ofDiospyros kaki(persimmon) with other wildDiospyros(Ebenaceae) species[J]. Tree Genetics and Genomics,2008, (4): 149-158.

[2]Kitagawa H, Glucina P. Persimmon culture in New Zealand[M].Science Information Publishing Centre: Wellington,New Zealand,1984:159.

[3]李 红,赵 忠,杨 勇,等.陕西省涩柿适宜栽培区的划分[J].西北林学院学报, 2009, 24(4): 76-79.

[4]Gretchen C. Daily,欧阳志云,郑 华,等.保障自然资本与人类福祉: 中国的创新与影响[J].生态学报,2013, 33(3):669-676.

[5]谭晓风,马履一,李芳东,等.我国木本粮油产业发展战略研究[J].经济林研究,2012,30(1):1-5.

[6]Weir B S, Johnston P R. Characterisation and neotypi fi cation ofGloeosporium kakiHori asColletotrichum horiinom. Nov [J].Mycotaxon, 2010, 111: 209-219.

[7]刘开启,牟惠芳,刘凤英.柿炭疽病的研究[J].山东农业大学学报,1988(19): 69-71.

[8]杨光道,段 琳,束庆龙,等. 油茶果皮花青素、糖含量和PAL活性与炭疽病的关系[J]. 林业科学,2007,43(6):100-104.

[9]雷新涛,赵艳龙,姚全胜,等.杧果抗炭疽病种质资源的鉴定与分析[J].果树学报,2006, 23(6): 838-842.

[10]吴良庆,朱立武,衡 伟,等.砀山梨炭疽病病原鉴定及其抑菌药剂筛选[J]. 中国农业科学,2010,43(18):3750-3758.

[11]彭邵锋,陆 佳,喻锦秀,等. 21 个山茶种质对炭疽病和软腐病的抗性研究[J].中南林业科技大学学报,2015,35(12):20-24.

[12]孙春英,毛胜利,张正海,等.辣椒抗炭疽病遗传与育种研究进展[J]. 园艺学报,2013,40(3):579-590.

[13]余贤美,侯长明,王 洁,等.山东牛心柿炭疽病菌的分离鉴定及致病性[J].林业科学,2015,51(4):126-133.

[14]余贤美,侯长明,王 洁,等.次郞甜柿炭疽病菌的分离鉴定及其rDNA-ITS序列分析[J]. 经济林研究, 2014,32(1):45-50.

[15]张敬泽,徐 同,何黎平. 浙江无核柿炭疽病菌鉴定及附着胞形成过程中的核相变化[J]. 菌物学报,2005,24(3):446-456.

[16]贾克锋,陈 雁,王利忠.日本甜柿炭疽病发生规律及防治技术[J]. 浙江林学院学报, 1997, 14(1): 45-49.

[17]张敬泽,徐 同.柿树炭疽病菌在越冬枝条上的菌态及数量[J].植物保护学报,2003,30(4):438-439.

[18]丁向阳,徐建强,邓全恩,等.柿炭疽病化学防治药剂的初步筛选[J]. 经济林研究,2015,33(4):148-151, 156.

[19]邓全恩,丁向阳,徐建强,等.柿炭疽病防治药剂的筛选[J].林业科学研究,2017,30(1):160-165

[20]潘金菊,慕 卫,翟茹环,等. 9种杀菌剂对苹果斑点落叶病菌和轮纹病菌的毒力比较[J].农药科学与管理,2006,27(6):16-18.

[21]刘永刚,李佳佳,李昭煜,等.枸杞炭疽病防治药剂筛选[J].植物保护,2016,42(1):230-234.