膀胱癌组织GPR48基因的表达及其临床意义

季德才，郝斌，姜利宁，董永良

(沧州市中心医院，河北沧州061000)

信号转导是维持细胞内环境稳定、协调细胞活动的重要过程，细胞表面的膜受体在其中发挥关键作用[1]。G蛋白偶联受体具有7个跨膜结构，是最大的膜蛋白家族，能够与多种膜信号分子相结合[2]，广泛参与多种生理和病理过程，如视觉、行为和情绪调控、免疫反应[3]、内环境稳定性调节以及肿瘤的发生发展等[4]。G蛋白偶联受体主要分为A型(视紫红质)、B型(分泌素受体家族)和C型(代谢型谷氨酸)，GPR48又称LGR48，属于G蛋白偶联受体超家族的A10亚型，其N端含有17个亮氨酸组成的重复序列，位于其激素结合区域。GPR48在肾[5]、毛囊[6]等组织器官发育中有重要作用；GPR48缺陷可导致胚胎死亡或胚胎发育障碍[7]。目前GPR48在组织器官发育中的功能已经明确，但GPR48在肿瘤发生发展中的作用所知甚少。本研究观察了膀胱癌组织GPR48基因表达变化，现分析其在膀胱癌发生发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年6月～2012年6月我院收治的膀胱癌患者83例。纳入标准：①术前未进行放化疗；②术后经病理诊断证实为膀胱癌；③有术中切除的膀胱癌组织标本和癌旁组织标本保存；④有完整的病历资料。排除标准：①合并肝肾疾病、其他肿瘤；②合并免疫系统疾病；③合并严重的心脑血管疾病；④合并感染性疾病。其中男62例、女21例；患者年龄24～76(56.29±18.16)岁，<60岁者27例，≥60岁者56例；肿瘤直径>5 cm者49例，≤5 cm者34例；分化程度低分化53例，中高分化30例；有淋巴转移39例，无淋巴转移44例；有远处转移53例，无远处转移30例；临床分期Ⅰ期61例，Ⅱ～Ⅳ期22例。本研究已获得医院医学伦理委员会审核同意，患者均签署知情同意书。

1.2 膀胱癌组织和癌旁组织GPR48 mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。先用TRIzol法提取组织或者细胞总RNA，按照RNA提取试剂盒的说明书操作。紫外分光光度计检测总RNA浓度及纯度，逆转录试剂盒进行逆转录，cDNA产物置于-20 ℃保存备用。实时荧光定量PCR引物序列：GPR48正向引物5′-TGTTTCAACCTTTTAAAGACTGTAGC-3′，反向引物5′-TAAAGGACTTAATGCCAAATGTGAT-3′；内参GAPDH正向引物5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，反向引物5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。PCR扩增体系为10 μL。反应条件：50 ℃预热2 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸55 s，进行35个循环。采用2-ΔΔCt表示GPR48 mRNA相对表达量。重复3次，结果取平均值。

1.3 膀胱癌组织和癌旁组织GPR48蛋白检测 采用免疫组织化学法。膀胱癌组织和癌旁组织样本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片；二甲苯脱蜡，100%、95%、85%的酒精浸泡水化，在98 ℃的枸橼酸钠溶液(0.01 mol/L，pH值6.0)中浸泡15 min进行抗原修复。为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block中孵育10～15min。滴加正常山羊血清室温封闭20 min，弃去血清，滴加GPR48一抗工作液(稀释比1∶150)，37 ℃孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min，滴加生物素二抗(稀释比1∶200)，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色，充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。以PBS替代一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。随机选取10个含有阳性细胞的200倍视野进行观察。按阳性细胞比例评分：无阳性细胞为0分，≤25%为1分，>25%～≤50%为2分，>50%为3分；按染色程度评分：无阳性着色为0分，浅黄色为1分，深黄色为2分，棕黄色为3分。两项得分之和为最终得分。癌组织最终得分高于癌旁组织为GPR48高表达，否则为低表达。

2 结果

2.1 膀胱癌组织、癌旁组织GPR48 mRNA相对表达量比较 膀胱癌组织、癌旁组织GPR48 mRNA相对表达量分别为4.68±2.24、1.12±0.31，P<0.05。

2.2 膀胱癌组织GPR48 mRNA相对表达量与患者临床病理参数的关系 GPR48 mRNA相对表达量与膀胱癌患者的年龄、有无淋巴结转移、有无远处转移和临床分期有关(P均<0.05)，而与患者的性别、肿瘤直径和分化程度无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 膀胱癌组织GPR48蛋白表达情况及其与患者预后的关系 免疫组化结果显示，患者中GPR48蛋白高表达者71例，低表达12例。手术后随访1～60个月，癌组织GPR48蛋白高、低表达者的生存曲线见图1。Log-Rank检验结果显示， GPR48蛋白低、高表达者术后5年总生存率分别为91.67%、57.75%，生存时间分别为(56.00±3.83)、(47.97±2.07)个月，P均<0.05。

表1 膀胱癌组织GPR48 mRNA相对表达量与患者临床病理参数的关系

图1 膀胱癌组织GPR48蛋白高、低表达患者的生存曲线

3 结论

GPR48蛋白含有3个主要的功能结构域，即胞外的N端，胞内的C端以及7跨膜结构域。GPR48是胚胎发育的关键调节因子，参与维持细胞微环境稳定[8]、促进内胚层发育[9]等。GPR48在机体的多种组织器官发育中也发挥作用，如调控胚胎肝脏发育[10]、促进性腺发育[11]、调节昼夜节律[12]、参与骨骼肌的葡萄糖和脂质代谢[13]等。GPR48还是骨形成和骨吸收过程的关键调节因子[14]，如在小鼠模型中，敲除GPR48基因后，导致成骨细胞分化和矿化过程被显著抑制，GPR48通过cAMP-PKA-Atf4信号通路，调节骨形成和骨重塑过程[15]。在成骨细胞中，骨形态发生蛋白(BMP)促进GPR48基因表达[16]。GPR48异常表达与多种疾病相关，如GPR48失活导致先天性AGR综合征[17]。GPR48在肿瘤的发生和恶性进展中也发挥作用；GPR48基因突变使得发生皮肤和胆道扁平细胞癌的风险增加[18]；GRP48通过调节Jmjd2a/AR细胞通路促进前列腺癌的形成[19]等。Xu等[20]在对皮肤癌形成机制的研究中发现，GPR48可通过调节MEK/ERK和Wnt/β-catenin信号通路活性促进肿瘤形成，本研究结果显示，膀胱癌组织GPR48 mRNA和蛋白表达高于癌旁组织，提示GPR48高表达可能参与并促进了膀胱癌的肿瘤形成，GPR48在肿瘤形成过程中可能发挥促癌基因的作用。本研究结果还显示，GPR48在膀胱癌患者癌组织中的表达水平与患者的年龄、淋巴结转移、远处转移和临床分期有关，提示GPR48高表达可促进膀胱癌病情的进展。

Luo等[21]对前列腺癌细胞小鼠移植瘤进行研究发现，沉默GRP48基因后，小鼠的存活率显著增加，且肺转移的发生率也明显下降；GPR48能够促进肺癌细胞的侵袭，敲除GPR48基因后，细胞增殖和侵袭能力均减弱[22]；GPR48基因沉默后，人宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力均被抑制[23]。以上研究结果提示，GPR48高表达可增强肿瘤细胞的侵袭能力。本研究结果显示，GPR48高表达者术后总生存率低于、生存时间短于GPR48低表达者，提示GPR48可作为判断膀胱癌患者不良预后的指标，与Wu等[24]在结肠癌中关于GPR48的研究结果一致。

综上所述，GPR48在结直肠癌的发生发展中起促癌基因作用。膀胱癌组织GPR48 mRNA表达情况有助于判断患者病情及预后。本研究的不足为样本数量较小。

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