HSP70小干扰RNA对人瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响

王杨杨，李小静

(安徽医科大学第一附属医院，合肥230022)

伤口愈合过程中以胶原蛋白为主的细胞外基质过度积聚可导致瘢痕形成[1]。目前瘢痕形成的具体机制并不明确，现有治疗手段(手术切除瘢痕、瘢痕内部药物注射、冷冻、激光和放射治疗等)均有造成二次损伤和皮炎、伤口愈合延迟、癌变等风险[2]。热休克蛋白(HSP)又被称为蛋白分子伴侣，属于压力应激蛋白。HSP具有多种生物学功能，如参与蛋白质的折叠、装配、转运以及成熟蛋白定位等；能使不成熟或者部分未折叠蛋白重新折叠[3～5]。在正常细胞中HSP表达量低，而在高温、中毒、病毒或细菌感染、缺血等应激条件下表达增强；推测其可能对瘢痕成纤维细胞具有保护作用，使细胞处于高度活化的代谢状态，产生过量的胶原蛋白或其他细胞基质蛋白，从而促进病理性瘢痕形成。但上述理论仅为推论，缺乏实验支持。2017年1～10月，本研究观察了HSP70小干扰RNA(HSP70 siRNA)对人瘢痕成纤维细胞胶原表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 收集我院整形外科手术切除的56例创伤后患者的瘢痕组织。患者男21例，女35例；年龄(36.24±14.56)岁；创伤部位为胸部14例、后背部21例、四肢21例；血尿常规及肝肾功能各项指标均正常，本次手术前均未接受药物和放射治疗。本研究已获得医院医学伦理委员会审核同意，所有患者签署知情同意书。试剂与仪器：DMEM培养液、FBS购自美国Gibco公司，青霉素、链霉素购自大连美仑生物技术有限公司，Lipofectamine®3000、TRIzol试剂、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司，HSP70 siRNA、无关序列、Real-time PCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司，RIPA蛋白裂解液、ECL发光液购自上海碧云天生物技术有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗人HSP70多克隆抗体、羊抗人GAPDH单克隆抗体购自美国Abcam公司，HRP标记的鼠抗兔和鼠抗羊二抗购自北京博奥森生物技术有限公司，胶原检测试剂盒购自英国Biocolor公司。二氧化碳培养箱(BB15，美国Thermo公司)，超微量核酸蛋白测定仪(ND2000，美国Thermo公司)，定量PCR扩增仪(7500，美国ABI公司)，凝胶成像仪(Tanon 4200 SF，上海天能科技有限公司)，酶标仪(ELX800，美国Bio-Tek仪器有限公司)。

1.2 瘢痕成纤维细胞分离和培养 于手术室无菌条件下切取瘢痕组织，转移至超净工作台中，灭菌PBS缓冲液冲洗4～5遍，无菌眼科剪和镊子除去表皮和皮下脂肪组织，将组织块剪成0.5～1.0 mm3，均匀涂布于无菌培养皿中，加入DMEM培养基(含10% FBS、10×104U/L青霉素、100 mg/L链霉素)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；每隔3天更换新鲜DMEM培养液，待细胞呈单层生长，汇合度以80%左右，按1∶2比例进行传代，采用第4～6代细胞行以下实验。

1.3 瘢痕成纤维细胞分组及HSP70 siRNA转染 取4×105个处于对数生长期的瘢痕纤维细胞接种于3.5 cm培养皿中培养24 h。设观察组、阴性对照组和空白对照组，每组3个培养皿。观察组和阴性对照组采用脂质体Lipofectamine®3000分别转染HSP70 siRNA、无关序列 24 h，操作步骤参照试剂说明书。对照组不转染。

1.4 相关指标观察

1.4.1 HSP70、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA表达 采用实时荧光定量PCR法。TRIzol试剂抽提细胞总RNA，参照RNA提取试剂盒的说明书操作。采用超微量核酸蛋白测定仪检测总RNA浓度及纯度(OD260/OD280)，逆转录试剂盒进行逆转录。PCR以GAPDH为内参照，HSP70正向引物序列5′-TCACGGTGCCCGCCTACTT-3′，反向引物序列5′-CGCTTGTTCTGGCTGATGTCC-3′；Ⅰ型胶原蛋白正向引物序列5′-CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC-3′，反向引物序列5′-TCCACATGCTTTATTCCAGCAAT-3′；Ⅲ型胶原蛋白正向引物序列5′-ATGAAGGTGAATTCAAGGCTGAAG-3′，反向引物序列5′-CCACCAATGTCATAGGGTGCAATA-3′；GAPDH正向引物序列5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物序列5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR扩增体系为10 μL，反应条件为50 ℃预热2 min，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸55 s，进行35个循环。采用2-ΔΔCt法计算HSP70、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白mRNA相对表达量。

1.4.2 HSP70、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达 采用Western blotting法。收集约1×107个细胞，RIPA蛋白裂解液抽提细胞全蛋白，BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。8% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后，湿转法将蛋白转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温震荡封闭1 h，TBS-T洗膜，滴加兔抗人HSP70多克隆抗体、羊抗人GAPDH单克隆抗体，4 oC孵育过夜。TBS-T洗涤后，分别加入HRP标记的鼠抗兔和鼠抗羊二抗，室温孵育1 h，加ECL发光液进行化学发光显影，凝胶成像仪观察蛋白条带，用Image Lab软件对结果进行灰度分析，用目的蛋白条带与内参蛋白(GAPDH)条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达量。

1.4.3 细胞培养液总胶原表达量 采用英国Biocolor公司的胶原检测试剂盒。收集各组转染24 h后的细胞培养液1 mL，加入Isolation与Concentration Reagent 200 μL颠倒混匀，置于冰水混合物中，孵育过夜，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；底层沉淀中加入Sircol Dye Reagent 1 mL，上下颠倒混匀，摇床摇晃30 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清；底层沉淀中缓慢加入750 μL预冷的氯仿，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清，底层沉淀中加入Alkali Reagent 250 μL，充分溶解5 min后，于酶标仪555 nm处测定OD值。

2 结果

2.1 各组HSP70 mRNA和蛋白表达比较 观察组HSP70 mRNA和蛋白相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，阴性对照组与空白对照组相比P均>0.05。见表1。

表1 各组HSP70 mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与阴性对照组、空白对照组比较，*P<0.05。

2.2 各组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白相对表达量比较 观察组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，阴性对照组和空白对照组相比P均>0.05。见表2。

表2 各组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白相对表达量比较

注：与阴性对照组、空白对照组比较，*P<0.05。

2.3 各组培养液总胶原蛋白水平比较 观察组、阴性对照组、空白对照组人瘢痕成纤维细胞培养液总胶原蛋白水平分别为(3.41±0.37)、(4.87±0.73)、(4.93±0.81)μg/mL。观察组低于阴性对照组和空白对照组(P均<0.05)，阴性对照组与空白对照组相比P>0.05。

3 讨论

成纤维细胞是真皮层最主要的修复细胞，是伤口愈合的基础和关键，也是胶原蛋白的主要来源。皮肤胶原蛋白中Ⅰ型胶原蛋白占85%～90%，Ⅲ型胶原蛋白占10%～15%，瘢痕成纤维细胞外基质的主要成分是Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白[6]，因此抑制其表达，可抑制瘢痕组织的形成。

HSP家族包含多个成员，HSP70是最具代表性的一种，其在应激状态下产生最多，且功能最重要。HSP70在细胞的多种生理和病理过程中发挥作用，如HSP70具有细胞保护作用，HSP表达增加可保护神经元免受缺血性损伤[7]、保护肺纤维细胞[8]等；HSP70参与免疫调节，促进系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发生发展[9]；HSP70与肿瘤的发生与恶性进展也密切相关[10]；在动物模型中外源性增加HSP70蛋白表达后可降低罹患小肠病变、阿尔茨海默病等疾病的风险[11,12]。

研究证实，多个HSP家族成员与瘢痕形成相关。Chen等[4]在动物瘢痕模型中沉默HSP47基因表达后瘢痕体积显著减小，且胶原蛋白合成较少；Yun等[13]发现，HSP90抑制剂(17-AAG)能够诱导瘢痕纤维细胞凋亡，减弱细胞侵袭迁移能力；Lee等[14]发现，HSP90在瘢痕组织表达增加；17-AAG能降低瘢痕组织中Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白、弹性蛋白和纤维连接蛋白的表达，其认为17-AAG有望成为治疗瘢痕的药物之一。Javad等[5]对瘢痕组织蛋白表达谱的研究表明，瘢痕组织中存在HSP60和HSP70蛋白的异常高表达。目前HSP70在瘢痕形成中的具体作用尚不明确。

RNA干扰是指由小非编码RNA(sncRNA)诱导信使RNA(mRNA)降解，从而抑制翻译或者形成异染色质等，进而引发基因沉默的现象[15]。根据生物合成与作用机制的不同，sncRNA分为三种，即小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和与Piwi蛋白相作用的RNA(piRNA)[16]。在瘢痕的病理研究中， siRNA干扰技术是一种有效的手段[17]。

本研究观察组用RNA干扰技术转染HSP70 siRNA抑制瘢痕纤维细胞HSP70基因表达，结果显示HSP70基因的转录(mRNA)和翻译(蛋白)均被抑制，Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA和蛋白相对表达量及上层培养液中总胶原水平均降低，表明瘢痕成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白的能力下降，分泌至上层培养液中的总胶原蛋白量明显减少。以上结果提示，抑制HSP70基因表达后瘢痕纤维细胞合成、分泌胶原蛋白的能力下降。研究证实，氧化苦参碱[18]、抗高血药物(卡托普利)[19]、免疫抑制剂(他克莫司)[20]等均可通过降低胶原蛋白合成发挥预防和治疗瘢痕。本研究结果进一步证实了上述结果。

综上所述，RNA干扰HSP70基因表达可抑制胶原蛋白合成与分泌，进而预防和治疗瘢痕形成。今后的研究将对HSP70调节胶原蛋白表达的机制进行深入探讨。

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