氨基酮戊酸光动力疗法对鳞状细胞癌细胞株A431蛋白激酶D1及其磷酸化位点的影响

顾静 王付亮 王来群 刘保国 周萌 苗国英 李小静

453400河南长垣，河南宏力医院皮肤科（顾静、王来群）；河北医科大学研究生学院（王付亮）；河北工程大学附属医院皮肤科（刘保国、周萌、苗国英、李小静）

皮肤鳞状细胞癌（鳞癌）发病原因主要与过量紫外线照射所致DNA损伤、修复功能紊乱以及宿主免疫耐受状态有关。目前，鳞癌的治疗多采用常规手术、激光、冷冻和放疗等方法直接去除或破坏肿瘤组织。氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）已用于治疗皮肤癌和癌前病变，其具体作用机制有待深入研究。蛋白激酶D1（PKD1）是钙离子/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶D家族中最重要的一员，参与调控细胞内多条信号传导通路，调节一系列细胞生物学行为，对维持表皮平衡发挥着重要的作用［1⁃4］。PKD1基因（PRKD1）位于人类染色体14qll位置，在多种恶性肿瘤组织中表达异常，其中包括黑素瘤、基底细胞癌等［5⁃8］。我们前期［9］实验也证实，其在皮肤鳞癌组织中明显高表达，且表达强度随着鳞癌组织恶性程度的增高而增强。本研究观察ALA⁃PDT对人皮肤鳞癌细胞株A431 PKD1及其磷酸化位点的影响，探讨PKD1是否在光动力疗法中发挥作用。

材料和方法

一、主要试剂及仪器

盐酸ALA外用散（ALA粉剂）（上海复旦张江生物医药有限公司）；胎牛血清、DMEM培养基、青霉素-链霉素、胰酶、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（美国Gibco公司）；细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK⁃8）（日本同仁化学研究所）；AnnexinV⁃FITC/PI双染法凋亡试剂盒（美国BD公司）；RIPA强效裂解液、BCA蛋白测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；浓缩型兔抗人PKD1多克隆抗体、酪氨酸位点Tyr463磷酸化PKD1（pTyr463）多克隆抗体、丝氨酸位点S916磷酸化PKD1（pSer916）单克隆抗体，滴度分别为1∶500、1∶1 000、1∶5 000（英国abcam公司）；二抗（山羊抗兔，北京中杉金桥生物技术有限公司）。其余试剂和耗材均由河北工程大学医学院中心实验室提供。LED⁃IB光动力治疗仪（武汉亚格光电技术有限公司）、核酸蛋白检测仪（英国Therno scientific公司）、ABI 7500型荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

二、方法

1.细胞培养：A431细胞株购自中国科学院上海细胞库，接种到含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，37℃、5%CO2恒温孵育箱中，每24～48小时换液，2～3 d当细胞增殖到80%～90%融合成片的单层细胞时，取对数生长期细胞按1∶2传代接种。

2.预实验：取对数生长期A431细胞，将ALA粉剂溶入DMEM培养基中，配置成终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L的ALA溶液，对数生长期细胞用胰酶消化后制成2×105/ml的细胞悬液，每孔100 μl接种到96孔板，置于温箱内培养24 h后，随机分为4组，每组9个复孔，弃原培养基，分别加入以上4种浓度的DMEM⁃ALA溶液，避光孵育3 h后接受波长632 nm、总能量分别为1、2、3 J/cm2的光动力治疗（每组ALA剂量所对应的各能量组均设3个复孔），24 h后行细胞增殖-毒性检测，实验重复3次取均值。筛选最佳的光照剂量和ALA浓度组合用于实验。

3.实验分组及干预：取对数生长期细胞随机分ALA⁃PDT组、ALA组、单纯光照组（PDT组）及对照组（不进行ALA或PDT处理）。ALA组和ALA⁃PDT组培养基加入ALA溶液，PDT组与对照组加入等体积的培养基，各组均避光孵育4 h后，更换培养基后备用。

4.CCK⁃8法检测细胞活力：按照上述方法将各组细胞予以相应处理后分别继续孵育12、24、36、48 h，每一时间点设8个复孔，以仅有培养基作为对照，周围一圈加等体积无菌PBS。向每孔加入10 μl CCK⁃8溶液，继续孵育3 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度（A值）。得到的A值去掉最大值和最小值，其余取均值计算细胞的增殖抑制率（IR）。IR=［1-（处理后A值-培养基A值）/（处理前A值-培养基A值）］×100%。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡率：收集各组对数生长期A431细胞，以5×105/ml接种于6孔板，2 ml/孔，待细胞贴壁后，用不含血清DMEM同步化24 h，按照方法3分组给予最佳的光照剂量和ALA浓度组合干预后培养24 h，每组设3个复孔，按照凋亡试剂盒说明书操作，检测各组细胞凋亡率，实验重复3次取均值。

6.反转录PCR测定ALA⁃PDT后不同时间点PRKD1 mRNA的表达：收集ALA⁃PDT作用于细胞后0、6、12、24、36、48 h的A431细胞，依照Total RNA 提取试剂说明书提取RNA。核酸蛋白检测仪检测RNA纯度后按照试剂盒要求的条件合成cDNA，所得反转录产物采用ABI 7500型荧光定量PCR仪扩增，引物及内参照由宝生物工程（大连）有限公司合成，PRKD1：正向引物 5′⁃ATGCAGCTTTCATGTATC CACCA⁃3′，反向引物 5′⁃GCATTCCAGCTCTCGCAA ATCTA⁃3′，产物177 bp；内参照GAPDH：正向引物5′⁃AGAAGGCTGGGGCTCATTTG⁃3′，反向引物 5′⁃AGGGGCCATCCACAGTCTTC⁃3′，产物 258 bp。计算mRNA的相对表达量（△△Ct），△Ct=Ct（PRKD1）-Ct（GAPDH），△△Ct=2⁃△Ct，每组重复3次取均值。

7.Western印迹法测定各组细胞中PKD1及其磷酸化位点的蛋白表达：收集每组细胞各1×107个，用RIPA裂解缓冲液提取蛋白，以BCA法测定并计算样品蛋白浓度，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜上，清洗后置于5%脱脂奶粉液中室温封闭。加一抗于4℃过夜后加二抗，避光条件下摇床振荡1 h，清洗后应用凝胶成像分析系统采图，ImageJ软件分析灰度值，以GAPDH作为内参，目的条带与内参照的灰度比值为蛋白相对表达量，各组实验重复3次取均值。

8.统计学分析：用SPSS 17.0软件进行统计学处理，实验数据用x±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析与两因素方差分析，用SNK⁃q检验进行组间多重比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同浓度ALA与照射能量下ALA⁃PDT对A431细胞增殖的影响

不同浓度ALA与照射能量下，ALA⁃PDT对A431细胞增殖抑制率间差异有统计学意义（F=41.49，P＜ 0.05），ALA浓度为1.5 mmol/L、光照剂量为2 J/cm2时的增殖抑制率高于其他浓度与光照剂量组（均P＜0.05）。见表1。

二、CCK⁃8法检测4组细胞不同孵育时间对增殖的影响

经处理的4组A431细胞孵育不同时间后的增殖抑制率差异有统计学意义（F=39.56，P＜0.05）。孵育24 h时，ALA⁃PDT组细胞增殖抑制率高于其他3组（均P＜0.05）。ALA⁃PDT组细胞孵育24 h的增殖抑制率高于12 h（P＜ 0.05），与36、48 h增殖抑制率差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图1。

三、流式细胞仪检测结果

经相应干预后24 h，对照组、ALA组、PDT组、ALA⁃PDT组细胞凋亡率分别为（4.67±0.88）%、（7.02 ± 1.52）%、（8.37 ± 0.59）%、（41.92 ± 3.23）%，组间差异有统计学意义（F=16.32，P＜0.05），ALA⁃PDT组高于其他3组（均P＜0.05）。见图2。

四、ALA⁃PDT后不同孵育时间点对PRKD1 mRNA表达的影响

ALA⁃PDT作用于A431细胞后0、6、12、24、36、48 h，细胞PRKD1 mRNA的相对表达量组间差异有统计学意义（F=22.24，P＜0.05），孵育后24 h低于孵育后0、6、12 h（均P＜ 0.05），与36、48 h 的相对表达量差异无统计学意义（均P＞0.05）。见图3。

五、ALA光动力疗法对A431细胞中PKD1及其不同位点磷酸化的影响

对照组、ALA组、PDT组、ALA⁃PDT组A431细胞中pSer916表达量差异无统计学意义（P＞0.05），PKD1和pTyr463表达量差异有统计学意义（均P＜0.05），ALA组、PDT组PKD1、pTyr463的相对表达量与对照组相比差异无统计学意义（均P＞0.05），而ALA⁃PDT组细胞中PKD1、pTyr463的表达低于对照组、ALA组、PDT组（均P＜0.05）。见表2。

表1 A431细胞经不同浓度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光动力疗法处理后24 h增殖抑制率（%，±s）

表1 A431细胞经不同浓度氨基酮戊酸（ALA）及照射能量光动力疗法处理后24 h增殖抑制率（%，±s）

注：n=6。a与相同ALA浓度不同照射能量组比较，P＜0.05；b与相同照射能量不同ALA浓度组比较，P＜0.05

ALA浓度（mmol/L）0.5 1.0 1.5 2.0照射剂量1 J/cm2 9.25±0.24 15.23±0.24 18.30±0.53 22.05±1.01 2 J/cm2 11.08±0.65 24.68±0.52 46.26±1.25ab 29.27±0.57 3 J/cm2 17.42±0.52 25.00±0.91 29.49±0.23 25.25±1.28

图1 氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）作用于A431细胞的时间-增殖抑制率曲线图

讨 论

图3 氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）作用A431细胞后蛋白激酶D1 mRNA的表达 与24 h组相比，a：P＜0.05；b：P＞0.05

表2 氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）作用于A431细胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位点Y463（pTyr463）与磷酸化丝氨酸位点S916（pSer916）相对表达量（±s）

表2 氨基酮戊酸光动力疗法（ALA⁃PDT）作用于A431细胞后蛋白激酶D1及其磷酸化酪氨酸位点Y463（pTyr463）与磷酸化丝氨酸位点S916（pSer916）相对表达量（±s）

注：n=3。a与对照组、ALA组、PDT组比较，均P ＜0.05

组别对照组ALA组PDT组ALA⁃PDT组F值P值蛋白激酶D1 2.15±0.33 1.96±0.41 2.05±0.16 0.88±0.14a 10.04＜0.05 pTyr463 1.02±0.25 0.85±0.36 1.01±0.07 0.46±0.06a 8.27＜0.05 pSer916 0.64±0.03 0.60±0.04 0.62±0.03 0.40±0.02 1.53＞0.05

图2 各组A431细胞接受相应干预24 h后流式AnnexinⅤ/PI双染法检测结果 2A：对照组；2B：仅氨基酮戊酸组；2C：仅光动力照射组；2D：氨基酮戊酸光动力照射组

皮肤鳞癌作为角质形成细胞来源的皮肤肿瘤，其发生与角质形成细胞增殖和分化的失衡密切相关，有研究证实，PKD1在角质形成细胞的增殖及分化过程中发挥重要作用［10］。PKD1促进细胞有丝分裂的机制尚不清楚。长期紫外线辐射损伤是皮肤鳞癌形成的主要因素之一，相关实验证实，中波紫外线通过Tyr463位点激活细胞中的PKD1，有助于已经遭受紫外线引起的角质形成细胞DNA突变继续扩散，甚至形成皮肤肿瘤［11］。

ALA⁃PDT是由光能激发光敏剂后引起光化学反应，选择性杀伤肿瘤组织而不破坏正常的组织结构，对周边正常组织损伤小，不产生瘢痕，可重复多次治疗［12⁃13］。我们的实验发现，PKD1及pTyr463在A431细胞中高表达，经ALA光动力作用后水平明显降低，甚至原本表达较低的pSer916变的更低，而单纯ALA组和单纯光照组与对照组相比无明显差异。推测PKD1在A431细胞中可能是通过Tyr463位点活化而促进癌变的发展，同时也提示PKD1可能参与ALA⁃PDT诱导鳞癌细胞凋亡的进程。

ALA⁃PDT疗法近年越来越多地运用于皮肤肿瘤的治疗，UVB在损伤角质形成细胞且激活PKD1的同时诱导活性氧（ROS）的产生［11］，而ALA⁃PDT疗法正是利用选择性聚集于肿瘤组织中的光敏剂，在一定波长的光激发下，发生一系列光化学反应，产生大量单态氧和活性氧自由基，从而杀伤肿瘤细胞。Zhang等［14］的相关研究揭示，PKD1参与线粒体去极化，是调节活性氧产生阈值的关键因素。我们在临床治疗中发现，ALA⁃PDT治疗24 h内部分皮损局部出现红斑、水肿及轻度糜烂等现象，并伴有忍受范围内的灼热感、痒感或者轻微疼痛，一般经冷敷或其他相应处理后约2 d可自行消退，这可能和ALA引起的光敏作用有关［15］。我们的实验显示，经ALA⁃PDT作用24 h时A431细胞的增殖抑制率和凋亡率达到最高，同时PRKD1 mRNA的表达较治疗前明显降低，36、48 h与其相比没有明显差别（均P＜0.05）。这种时相上的同步，提示PKD1可能参与ALA⁃PDT疗法中的光化学反应进程，具体机制值得进一步研究。

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