基质辅助激光解吸电离-傅里叶变换离子回旋共振质谱技术用于食用油中甘油三酯的快速分析

李卫峰 杨秋霞 林泽鹏 王李平 郭鹏然

(广东省测试分析研究所，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省原位电离质谱分析工程技术研究中心，广州 510070)

1 引 言

食用油是食品中脂肪的重要来源，全球每年消耗的食用油超过1.7亿吨[1]，但摄入不当会引发诸多疾病，如肥胖症、心血管疾病[2]、肝功能异常[3]等。食用油中主要成分是甘油三酯(TAG)，因甘油链上脂肪酸的碳数或饱和度不同而种类繁多。不同种类的食用油因含有的TAG种类不同而使其营养价值和功效有着很大的差异。此外，由于不同种类食用油相似度高，难以区别，食用油掺假问题日趋严重。因此，发展一种食用油中TAG的快速、直接的分析方法在食品安全领域具有重要价值。

目前，食用油的分析方法种类很多，包括色谱法[4,5]、核磁共振波谱法[6]、红外光谱法[7]和基于质谱的分析方法[8]等。质谱由于具有检测速度快、灵敏度高、优异的检出限等优点而应用更为广泛。基于质谱建立的方法主要包括气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[9,10]、液相色谱质谱联用法(LC-MS)[11～13]和直接进样质谱法。与色谱-质谱联用方法相比，直接进样质谱技术避免了色谱分离或衍生化的过程，具有样品分析速度快、通量高、易操作等特点，是当前分析技术的热点[14]。目前，用于食用油中TAG的直接进样质谱离子源技术主要包括电喷雾离子源(ESI)、大气压化学电离源(APCI)、基质辅助激光解吸电离源(MALDI)等[14～16]。其中，ESI源主要适用于测定其中的脂肪酸、酚类等极性成分，且有时需盐离子辅助才能获得好的信噪比谱图。而APCI源则用于测定中等极性或弱极性的组分，由于APCI源获得的谱图有3种特征的碎片离子，根据碎片离子的信息可推断TAGs的组成及脂肪酸的酰基位置[17]。与ESI源和APCI源溶液进样方式相比，MALDI源可直接作用于固体样品，具有样品制备方便、易操作、耐盐度好的优点，已被广泛应用于油品的快速定性分析[18～20]。

本研究利用MALDI-FTICR-MS对食用油中的TAG进行了定性分析，建立了一种简便、快速分析食用油中TAG的方法。根据一级质谱图可初步区别不同种类的食用油，利用主成分分析软件(PCA)可高效区分34种不同种类的食用油，并应用于橄榄油中掺杂菜籽油的识别分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

SolariX XR 7.0T傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FTICR-MS，美国Bruker公司)，配有电喷雾电离源(ESI)、大气压化学电离源(APCI)和基质辅助激光解吸电离源(MALDI)等。其中MALDI源的Smartbeam II固态激光器的能量在0～300 μJ可调，频率在0～1 kHz可调，激光波长为355 nm，激光光斑可调。WH-3微型漩涡混合仪(上海泸西分析仪器有限公司)。

丙酮、二氯甲烷(分析纯，广州化学试剂厂)；三氟乙酸钠(NaTFA)、2,5-二羟基苯甲酸(DHB, 纯度≥99%)，购自美国Sigma-Aldrich公司；除猪油自制外，不同品牌的花生油、菜籽油、橄榄油、玉米油、大豆油、向日葵油等共34种食用油均购自本地超市。

2.2 实验方法

2.2.1样品制备(1)食用油样品制备 准确移取4 μL样品，分别溶于1 mL二氯甲烷，混匀待测。(2)掺杂食用油制备 将菜籽油与橄榄油按不同体积比(0%、5%、10%、20%、40%、60%)配制成系列混合食用油样品，然后准确移取4 μL样品分别溶于1 mL二氯甲烷后，混匀待测。(3) DHB基质制备 将1 mg DHB溶于500 μL丙酮溶液。(4) MALDI点样 先移取1 μL基质溶液于MALDI样品靶上，待基质自然晾干形成结晶层，再移取1 μL制备好的食用油样品点于结晶层上，待进样分析。

2.2.2质谱条件采用MALDI源正离子模式，激光能量为15%，光斑选择为Medium模式，频率为100 Hz，辐照次数为100 Shots，作用路径为Random。质量采集范围m/z50～1500，采样大小为1 M，累加次数为8，和谐阱累积时间设为2 ms。进行二次质谱测定时，隔离窗口(Isolation window)设为10，碰撞能量为25 eV。数据采集及数据分析采用仪器配有的DataAnalysis 4.4和ProfileAnalysis 2.2软件进行处理。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的考察

对于MALDI源，基质结晶质量决定了质谱信号的稳定性。据报道，对于分析食用油中的TAG而言，当采用DHB的丙酮溶液作为基质时，先点基质再点样品的分步点样方式可以获得更为稳定的质谱信号和强的信噪比[21]。因此，在实验过程中，采用分步点样方式进行制样。以往的文献报道中多采用氯仿或者正己烷等毒性较低的溶剂来溶解食用油，本实验采用毒性更低的二氯甲烷作为溶剂进行样品制备。激光的相关参数(如激光频率、激光能量、激光光斑等)是影响质谱图质量的重要因素。在一定的激光光斑条件下，增加激光能量和频率会增强离子流，但是如果离子流太强，过剩的离子会在质量分析器中发生严重的电荷排斥现象，影响质量轴的精度。为保证质量轴精度，选择激光能量为15%，激光频率为100 Hz，辐照次数为100 Shots，光斑为Medium模式进行后续实验。以4种不同的橄榄油作为代表进行了重复性验证。经过重复测定质谱图中m/z881.76081与m/z907.77650的峰强度比后，对4种橄榄油均可以获得良好的重复性，相对标准偏差(RSD)均低于9%，表明本方法的可行性良好。

3.2 食用油样品分析

3.2.1不同种类食用油的分析为确保分析结果的准确性，每次实验之前均在ESI源正模式条件下用三氟乙酸钠校正液对质量轴校正。图1A为玉米油样品MALDI-MS的归一化质谱图，其中青色区域代表TAG的钠离子复合峰[TAG+Na]+，粉色区域代表甘油二酯(Diacylglycerol, DAG)离子峰或TAG的碎片。由图1A可知，DAG与TAG的比例与食用油本身含有的比例相差较大。这是因为大部分DAG由TAG碎裂形成，所以在图1A中将甘油二酯的区域标记为DAG or fragments。图1B是甘油二酯的局部放大图，二酯类成分主要由含18个碳的脂肪酸，如亚麻酸(Ln，C18H30O2)、亚油酸(L，C18H32O2)和油酸(O，C18H34O2)两两组合而成。TAG的局部放大图如图1C所示， TAG共分两类，一类只含单个的棕榈酸(P，C16H32O2)，另一类不含棕榈酸。通常，根据以上两类TAG的含量或特征峰可初步识别不同类型的食用油。

图1 玉米油的MALDI-FTICR-MS质谱图，质荷比范围分别为(A) m/z 400～1000，(B) m/z 596～605，(C) m/z 870～915。P: 棕榈酸; Ln: 亚麻酸; L: 亚油酸; O: 油酸; S: 硬脂酸。Fig.1 Typical matrix-assisted laser desorption/ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectra (MALDI-FTICR-MS) of corn oil at various mass-to-charge ranges: (A) m/z 400-1000, (B) m/z 596-605 and (C) m/z 870-915. P: palmitic acid; Ln: linolenic acid; L: linoleic acid; O:oleic acid; S: stearic acid.

图2 不同种类食用油中的TAGs的MALDI-FTICR-MS质谱图: (A)大豆油, (B)向日葵油, (C)花生油, (D)玉米油, (E)菜籽油, (F)橄榄油和(G)动物油Fig.2 MALDI-FTICR-MS spectra of triacylglycerols (TAGs) from different edible oils: (A) soybean oil, (B) sunflower oil, (C) peanut oil, (D) corn oil, (E) canola oil, (F) olive oil, (G) animal oil.

图2为7种不同类型食用油中的TAG的质谱图, 可见利用一级质谱图很容易区分植物油与动物油，这主要是因为与植物油相比，动物油中含有的棕榈酸比例增加，其低质荷比的TAG所占的比例升高[16]。根据此特点，可以快速区分植物油与动物油。对于6种植物油来说，虽然成分类似，但根据TAG的谱图也可进行初步的识别。由图2可知，橄榄油主要由单一的不饱和脂肪酸油酸(O)构成，谱图简单，根据特征峰m/z881.76081(POO)与m/z907.77650(OOO)的比例即可与其它食用油进行区分。与其它植物油相比，菜籽油低质荷比的TAG(如m/z881.76150)所占的比例最小。与玉米油比，向日葵油的特征峰m/z877.73150(PLL)与m/z903.74614(LLO)峰值比例降低。花生油中油酸成分增加，所以TAG中m/z879.74620(PLO)与m/z905.76158(LOO)变为特征峰。由于亚油酸含量增加，大豆油的TAG以m/z877.73201(PLL)与m/z901.73202(LLL)为最高含量，以上获得的谱图结果与之前报道的结果基本类似[1]。因此，根据一级质谱可对不同种类的食用油进行初步的定性分析。

图3 不同种类食用油中不同类型TAG的碎片质谱图: (A)玉米油m/z 877.72547二级谱图，(B)玉米油m/z 903.74150二级谱图，(C) 橄榄油m/z 881.75700二级谱图，D)橄榄油m/z 907.77253。Fig.3 Various TAG fragments mass spectra from different types of edible oils: (A) m/z 877.72547 in corn oil, (B) m/z 903.74150 in corn oil, (C) m/z 881.75700 in olive oil, (D) m/z 907.77253 in olive oil.

3.2.2不同种类食用油的二级谱图为了进一步对食用油中TAG的定性分析进行探究，以玉米油和橄榄油为例对部分TAG进行了二级谱图比较。如图3所示，当选取玉米油中母离子m/z877.72547进行二级质谱实验时，碎片离子分别为m/z597.48529和621.48509。经过计算推导得知，以上获得的碎片峰是由TAG去掉一个亚油酸或棕榈酸形成，即[PL+Na]+和[LL+Na]+。当选取母离子(m/z903.74150)进行二级实验时，碎片峰来源主要是通过脱掉一个亚油酸或亚油酸钠后形成，分别为[LO+Na]+和[LO+H]+，主要以Na+复合峰为主[22]。此外，对于橄榄油，m/z881.75700的碎片是通过脱掉一个油酸分子(O)或者棕榈酸分子(P)形成，即[PO+Na]+和[OO+Na]+。m/z907.77253的碎片则是脱掉一个油酸或油酸钠后形成，具体信息见图3C和3D。橄榄油和玉米油的二级谱图说明，二级谱图为定性分析提供了更为丰富的信息。总之，低质荷比的TAG的碎片峰断键的方式有两种，而高质荷比的TAG断键方式只有一种，根据二级图谱碎片碎裂的信息，可以初步获得所测样品中TAG的脂肪酸组成及各个脂肪酸饱和度等定性分析的信息[21,23,24]。

3.2.3主成分分析通过一级质谱图中TAG的分布可初步区别不同种类的食用油，但在实际分析中，食用油种类繁多，样本复杂，应利用统计学进行快速筛选分类。本研究采用主成分分析方法对34种食用油进行分类。在m/z860-920质荷比范围内经过归一化处理后进行数据处理并分析，结果如图4和图5所示(PCA图中每个点代表一个样品)。由图4可知，在置信度为95%的条件下，同一类样品得到了很好的归类，且7类食用油得到很好分离，其中PC1和PC2的差异值分别为66.7%和80.6%(图5)，表明MALDI-FTICR-MS技术能够有效区分不同种类食用油，为食用油的筛查和鉴定提供了基础。

图4 34种食用油的主成分分析的得分图(A)和载荷图(B)Fig.4 Principal component analysis (PCA) results of 34 kinds of edible oils: (A) scores plot and (B) loadings plot

图5 不同主成分的差异值Fig.5 Variance value of different principal components

3.3 橄榄油中菜籽油掺杂量与峰强度比的关系

由于含有丰富的不饱和脂肪酸及其它多种易被人体消化吸收，且具有一定美容功效的缘由，橄榄油被人们誉为“液体黄金”，其价格长期以来一直居高不下。一些不法分子常会在橄榄油中掺入其它低价格的食用油，由于掺入的食用油的脂肪酸成分与橄榄油高度相似，常规手段很难进行快速识别。为验证MALDI-FTICR-MS方法对食用油快速准确的识别能力，本研究在橄榄油中掺入了不同比例的菜籽油进行分析，归一化的质谱结果如图6所示。以往的文献报道中，根据特征峰如低质荷比的TAG(如m/z881.76)和高质荷比的TAG(m/z907.78)的比例变化即可识别橄榄油中是否掺杂菜籽油[1]。本研究直接利用高质荷比的TAG的变化进行识别区分。由图6可知，随着菜籽油掺入比例的增加，相比于m/z907.77586，m/z903.74481的强度逐渐增加，因此通过m/z903.74481和m/z907.77586的相对强度也可对食用油掺杂进行识别。每组数据平行测定5次，以I903.74481/I907.77586或I901.72957/I905.76004强度的平均值与掺入的菜籽油比例作图，在0%～60%含量范围内可以获得良好的线性关系(图7)。即使掺杂5%的菜籽油也可被直接快速识别。这些结果表明，当采用高质荷比的TAG的变化趋势作为研究对象时，MALDI-FTICR-MS同样具有食用油掺杂的快速识别能力。

图6 m/z 903.74481和m/z 907.77586谱峰强度随着橄榄油中菜籽油含量的变化趋势Fig.6 Intensity of m/z 903.74481 and m/z 907.77586 as a function of canola percentage in olive

图7 (A) I901.72957/I905.76004和(B) I903.74481/I907.77586强度比与菜籽油中掺杂橄榄油的含量线性图Fig.7 Plot of intensity ratio of I901.72957/I905.76004 (A) and I903.74481/I907.77586 (B) against percentage of canola in olive oil

4 结 论

本研究建立了一种用于食用油中TAG的MALDI-FTICR-MS直接快速分析方法。结合一级和二级质谱图可以快速区分不同种类的食用油，并可提供脂肪酸组成及各个脂肪酸的饱和度信息。利用主成分分析法，可以明显地将34种食用油分为7类，通过高质荷比的TAG的变化趋势可直接识别掺杂5%菜籽油的橄榄油。本方法简便、快速、可靠， 有望成为快速筛查食用油的有效分析方法。

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