一株APMV-4毒株的分离鉴定及其PCR检测方法的建立*

杨金兴，袁小远，孟凯，李莉，王友令

（山东省农业科学院家禽研究所，山东 济南 250023）

副黏病毒科腮腺炎病毒属的APMVs分为9个血清型(APMV 1～9)。在所有血清型当中，最为熟悉的是新城疫病毒，它是禽副黏病毒1型的代表毒株；但是针对APMV 2～9的研究非常少[1,2]。APMV-4的基因组全长是15054个核苷酸，并与副黏病毒的“六规则”一致。和NDV相同，APMV-4基因组也包含6个非重叠的基因：NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）、M（膜蛋白）、F（融合蛋白）、HN（血凝素-神经氨酸酶蛋白）和L（RNA依赖性聚合酶）。本研究对分离鉴定的APMV-4型毒株进行PCR检测，建立的检测方法可有效地区分APMV-1型和APMV-4型毒株，为APMV-4的研究提供重要的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及其背景资料、试验动物 APMV-1所用毒株为NDV的GM强毒株、APMV-4 QY毒株均由山东省SPF鸡研究中心分离鉴定保存。NDV抗原和血清、SPF鸡胚均来自山东省SPF鸡研究中心。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒购自百泰克生物公司、One step RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 毒株分离鉴定 病鸭的组织 （气管、肝脏等）按1：2体积加入灭菌生理盐水，研磨、无菌处理、离心后取上清，按0.1ml/枚的接种量接种9日龄SPF鸡胚3个，弃去24h内的死胚，每6h照蛋一次。收集尿囊液，按常规方法进行血凝和血凝交叉抑制试验。

1.2.2 PCR方法的建立

1.2.2.1 引物设计 参照GenBank中APMV-4的全基因组序列 （No：KC439346）设计 1对引物APMV4-F/R。引物由华大基因公司合成，PAGE plus级别纯化。

APMV4-F：5′-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3′

APMV4-R：5′-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3′。预计扩增约800bp。

1.2.2.2 RNA提取 取GM和QY毒株各200μl的尿囊液来提取病毒RNA，提取过程按照百泰克生物公司的RNA提取操作进行，最后用25μl DEPC水来溶解RNA，提取后立即进行后续的RT-PCR。

1.2.2.3 一步法RT-PCR检测和敏感性试验

50μl的 RT-PCR 体系如下：RNA 模板 10μl、2×PCR Buffer（含 dNTP） 25μl、混合酶（RTase、HS-taq、RNase inhibitor）2μl、Primer-F/R (20μm) 各1μl、RNase-free H2O 补充至 50μl，设 NDV GM 的RNA和水作为对照。RT-PCR反应条件经优化确定为：RT 42min 30℃，94℃ 3min；随后进行 PCR扩增 94℃ 20s、50℃ 30s、72℃ 30s 进行 35 个 循环，最后72℃延伸4min。取5μl反应产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外观察条带。将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行上述RTPCR操作，确定该方法的敏感性。

2 结果

2.1 毒株分离 HA检测证实分离毒具有血凝性，效价为4～51og2。HI交叉抑制试验表明其与AIV、NDV、IBV、EDS均无交叉反应。经随机引物扩增，序列测定、blast比对确定其为APMV-4病毒。

2.2 RT-PCR 扩增 APMV-4分离毒株PCR扩增得到预期大小的扩增片段，约0.8kb。对照组GM NDV（即APMV-1病毒）在此处未出现扩增条带，见图1。

2.3 敏感性试验 将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行RT-PCR操作。扩增结果显示本方法的检测最小量可为102EID50，说明建立的检测方法灵敏性较好。

图1 一步法RT-PCR检测结果

2.4 临床应用 选取14份动物攻毒试验后的组织样品进行上述One-step RT-PCR方法的检测。结果检测出了11株阳性样品，经序列比对证实为APMV-4病毒。

3 讨论

针对APMV-4的研究较少，国内只检索到其荧光定量检测方法的文章[3]。近几年来从香港、韩国、南非等地陆续有家养禽、野禽等分离到毒株的报道[4,5]。APMV 2～9诱导NDV感染的机体产生的免疫保护能力也不尽相同[6]。SH Kim等构建了APMV-4的反向遗传系统，证实F蛋白裂解位点的氨基酸序列并不是病毒感染力的决定因素[7]。

本文建立了可用于检测APMV-4的一步法RT-PCR方法，该方法能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库，即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，减少了反应时间。特异性试验表明本方法特异性强，与新城疫病毒(NDV)无交叉反应；灵敏度高，检测最小量可为102EID50。因此，本文所建立的一步法的RT-PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV-4样品的检测，非常适合基层实验室的应用。

[1] Alexander D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Revue Scientifique Et Technique,2000,19(2):443-62.

[2] Swayne D E.Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Avian Metapneumovirus Infections[M].Diseases of Poultry,2013:87-138.

[3] 王静静,刘华雷,王英丽,等.禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立 [J].中国动物检疫,2014(3):68-71.

[4] Abolnik C,De C M,Rees J.Full genomic sequence of an African avian paramyxovirus type 4 strain isolated from a wild duck[J].Virus Genes,2012,45(3):537-541.

[5] Nayak B,Kumar S,Collins P L,et al.Molecular characterization and complete genome sequence of avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75[J].Virology Journal,2008,5(1):124-124.

[6] Nayak B,Dias F M,Kumar S,et al.Avian paramyxovirus serotypes 2-9(APMV-2-9)vary in the ability to induce protective immunity in chickens against challenge with virulent Newcastle disease virus (APMV-1)[J].Vaccine,2012,30(12):2220-2227.

[7] Kim S H,Xiao S,Shive H,et al.Mutations in the Fusion Protein Cleavage Site of Avian Paramyxovirus Serotype 4 Confer Increased Replication and Syncytium Formation In Vitro but Not Increased Replication and Pathogenicity in Chickens and Ducks[J].Plos One,2013,8(1):e50598.□

食尚资讯 冬季食疗养生首选海参，海参哪些吃法最受欢迎

冬季滋补吃什么？大雪掀起海参热。

在大连、山东一带，许多人刚过秋天就开始囤购海参，因为海参中富含的氨基酸、海藻素等有助于人们提高抵御疾病的能力，减少病毒性感冒的患病几率，也能减少陈年疾病的复发。就病理生理学方面而言，首先，冬天气温低，毛细管收缩，外周阻力增大，高血压，脑溢血的风险有所增加，而研究表明海参有明显的舒展血管的功效；其次，冬天人们的运动量明显减少，寒冷还容易使人内分泌失调，诱发支气管炎、肺炎等，海参的粘多糖有提高人体免疫力的作用。在滋补养生方面，海参更具有“八珍之首”之称，可以养血润燥、补肾固本。

保全营养不流失，海参做法有讲究。

海参是一种低胆固醇、低脂肪、高蛋白的食物，营养价值丰富，为了在食用过程中营养成分最大吸收，海参的做法也很有讲究。宫品海参相关负责人向我们介绍了海参的常见做法：

一、炖是海参最正确、最健康的做法。海参与瘦猪肉、鸡肉、羊肉一起小火炖煮或煲汤，肉质鲜嫩，汤汁鲜美，能缓解肠燥便秘、小便频数。切记高温，容易导致营养成分的分解流失。

二、熬粥也是冬季海参的最佳食用方法之一。配上枸杞、胡萝卜等熬粥，味道鲜美，有利于海参自身营养的释放，并且容易操作。

三、水煮海参的营养价值虽不及前两种，但寒冬腊月，水煮海参确也不失为一种家常的做法，方便快捷，先武火烧沸，在文火煮上半小时即可。

四、海参的错误打开方式，海参最忌讳红烧，因为红烧会使营养成分大量流失，滋补效果大大降低。另外，做海参时切忌使用高压锅，锅内过高的温度也会造成营养物质的流失。