艾塞那肽与胰岛β细胞凋亡的相关性研究

左 强， 陈 轩， 徐 亮

西南医科大学附属医院胃肠外科，四川 泸州 646000

2型糖尿病是一种由遗传因素、环境因素共同作用而形成的多基因遗传性疾病，又称为非胰岛素依赖性糖尿病，胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)和胰岛β细胞功能障碍导致胰岛素分泌不足是其发病的两个基本环节，但其确切机制尚未阐明。其传统疗法包括严格饮食控制、运动锻炼、口服降糖药物、注射胰岛素，但传统疗法难以保持患者血糖长期稳定，也不能从根本上防止糖尿病各种并发症的发生和发展，患者最终多死于各种慢性并发症，其中以心脑血管疾病和恶性肿瘤最为多见。自1995年PORIES等[1]进行统计研究发现胃转流手术(gastric bypass，GBP)可治愈糖尿病以来，人们对其作用机制进行了不断的探索研究，发现2型糖尿病患者在GBP术后血糖得到有效控制与其体内的一些神经体液因素的变化密切相关，包括胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)、瘦素、胰岛素样生长因子-1、缩胆囊素、脂肪细胞因子等，其中最为重要的是GLP-1。GLP-1在远端小肠分泌，并于GBP术后分泌明显升高，产生肠促胰岛素效应，被认为是糖尿病患者术后血糖得到控制的最核心的介导因子[2-8]。GLP-1在体内可被广泛存在的二肽基肽酶-4(DPP-4)快速灭活，而艾塞那肽是GLP-1的类似物，不仅模拟了GLP-1的功能，还不会被DPP-4灭活，是近年来用于临床的新型短效降糖药，具有有效控制血糖、保护β细胞、减轻体质量、保护心血管、改善非酒精性脂肪性肝病等疗效[9]，但其具体作用机制尚不明确。糖尿病发病的机制是胰岛素分泌不足和IR，而早在2004年OZCAN等[10]就提出细胞的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是导致IR、肥胖和糖尿病发生的重要途径，他们认为ERS与糖尿病的发生密切相关。在ERS时，应激活化的蛋白激酶是细胞内发生明显变化的分子之一。应激活化的蛋白激酶或称为c-jun氨基末端激酶(JNK)能被各种外界刺激如紫外线、炎症因子等刺激而发生磷酸化，而磷酸化的JNK(p-JNK)可介导IR。β细胞对ERS十分敏感，ERS介导的β细胞凋亡是糖尿病发病的重要机制[11]。由此我们推测，GBP可能通过增加GLP-1的分泌，抑制胰岛β细胞的ERS，并通过调节JNK信号通路，保护胰岛β细胞，从而达到治疗2型糖尿病的效果。为此，我们设计了本实验进行验证。

1 材料与方法

1.1材料与试剂RIN-m5f细胞株购自上海艾睿生物科技有限公司，RPMI 1640培养基购自HyClone公司，胎牛血清购自杭州四季青，胰酶、双抗购自索莱宝公司，艾塞那肽(Exendin-4)购自美国MedChemexpress生物科技公司(上海)，CHOP(鼠)、BIP(兔)、Phospho-JNK(兔)、Caspase-3(兔)抗体购自Cell Signaling Technology公司，RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂(PMSF)、BCA蛋白浓度测定试剂盒、β-actin、鼠二抗、兔二抗、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液、PVDF膜、Tween-20、Glycine、SDS、Tris、ECL发光试剂盒、彩色预染蛋白质分子量标准、凝胶配制试剂盒、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天，磷酸酶抑制剂混合物Ⅱ购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1 RIN-m5f细胞培养：RIN-m5f细胞用RPMI 1640+质量浓度为120 g/L胎牛血清+10 g/L双抗完全培养基放入体积分数为5%的CO2、37 ℃培养箱中贴壁培养，待细胞增殖到占瓶底约80%时用质量浓度为12.5 g/L的胰酶消化2 min后传代。

1.2.2 分组刺激：将一瓶长至约80%的细胞胰酶消化后取一半细胞按1∶3传代，分成3组：对照组加入含正常糖(11.1 mmol/L)的完全培养基；高糖组(11.1 mmol/L、33.3 mmol/L)使用不同含糖量的完全培养基,间歇性高糖为高糖与正常糖交替(每24 h更替1次培养基)，刺激第1天使用高糖(33.3 mmol/L)；高糖+艾塞那肽(100 nmol/L)组在高糖组培养的基础上每天加入艾塞那肽培养；三组在体积分数为5%的CO2、37 ℃培养箱条件下培养7 d。取对数期生长的RIN-m5f细胞，以2×104种植于96孔板，每组5个复孔，按以上条件培养7 d，按照说明书行细胞活力检测(OD值)。

1.2.3 Western blotting法检测蛋白表达：常规方法提取细胞蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳检测各组细胞内CHOP、BIP、p-JNK、Caspase-3表达水平。使用Bio-rad的Quantity One分析条带，用目的蛋白的积分光密度值(IOD值)/内参的IOD值来表示目的蛋白表达的相对水平。

2 结果

2.1MTT检测细胞活力各组细胞活力OD值：对照组为0.9333±0.0451，高糖组为0.3567±0.0252，高糖+艾塞那肽组为0.5867±0.0153。高糖组细胞活力较对照组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；高糖+艾塞那肽组细胞活力较高糖组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，见图1)。

注：与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05。

2.2Westernblotting方法检测结果对照组细胞中CHOP、BIP、p-JNK、Caspase-3蛋白表达水平较低；高糖组细胞中CHOP、BIP、p-JNK、Caspase-3蛋白表达水平较对照组明显升高(P<0.05)；高糖+艾塞那肽组细胞中CHOP、BIP、p-JNK、Caspase-3蛋白表达水平较高糖组则明显降低(P<0.05，见表1、图2～3)。

图2 三组RIN-m5f细胞中BIP、CHOP、p-JNK、Caspase-3蛋白表达的Western blotting结果 A：对照组；B：高糖组；C：高糖+艾塞那肽组Fig 2 Western blotting results of BIP, CHOP, p-JNK, Caspase-3 proteins in three groups of RIN-m5f cells A: control group; B: high glucose group; C: high glucose + Exendin-4 group

注：与对照组比较，aP<0.05;与高糖组比较，bP<0.05。

组别nBIPCHOPp⁃JNKCaspase⁃3对照组30．3840±0．03890．0285±0．00570．4588±0．12560．6349±0．1256高糖组30．9862±0．1577a0．0686±0．0081a2．1860±0．2356a2．3640±0．2238a高糖+艾塞那肽组30．3591±0．0641b0．0495±0．0034b1．3530±0．0387b1．4210±0．3145b

注：n:实验重复次数；与对照组比较，aP<0.05；与高糖组比较，bP<0.05。

3 讨论

细胞内质网的主要功能是加工运输蛋白质和贮存Ca2+，其功能紊乱时导致错误折叠及未折叠的蛋白在内质网腔内聚集及Ca2+平衡紊乱的状态，称为ERS。ERS时，细胞通过激活未折叠蛋白反应(unfolded protein reaction, UPR)以恢复内质网的稳态[12]。在UPR中[13]，免疫球蛋白重链结合蛋白(BIP，又称葡萄糖调节蛋白-78，GRP78)起关键作用，它可以与内质网上错误的或未折叠的蛋白质结合，促进蛋白质的正确折叠，减少内质网上非正常蛋白质的聚集。但ERS反应太强或持续时间太长，会使ERS特异的转录因子CHOP及BIP表达大大增加，故BIP和CHOP常被用作细胞ERS的标志蛋白。本研究结果中，与对照组比较，高糖组细胞ERS标志蛋白BIP和CHOP表达均明显高于对照组，提示间歇性高糖刺激可以诱导RIN-m5f胰岛素瘤细胞产生ERS。

JNK是目前发现的丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)中的4种亚型之一，大量磷酸化的p-JNK激活JNK信号通路可导致细胞分化改变，甚至凋亡[14]。本研究中，间歇性高糖刺激使细胞p-JNK、Caspase-3表达明显增加，提示细胞ERS时可能通过调节p-JNK表达增加，进一步导致细胞凋亡。

研究[15]证实，GLP-1可延缓胃排空，控制空腹血糖。艾塞那肽作为新型降糖药物，在控制血糖平稳、改善胰岛β细胞功能、减轻IR等方面效果明显[16]。本实验中，与高糖组相比，在高糖+艾塞那肽组中细胞内BIP和CHOP的表达受到明显抑制，说明艾塞那肽可以明显抑制ERS。同时，高糖+艾塞那肽组中细胞内p-JNK及Caspase-3的表达水平也明显低于高糖组，说明艾塞那肽可能通过抑制胰岛细胞ERS而抑制JNK的磷酸化水平影响JNK信号通路，并最终抑制Caspase-3表达，抑制胰岛细胞的凋亡。

GLP-1在GBP术后病情长期缓解的糖尿病患者中显著升高，而在不缓解或复发的患者升高不明显甚至不升高[4]，提示GLP-1可能是GBP治疗2型糖尿病的主要因素。本实验中，GLP-1的类似物艾塞那肽在体外明显抑制RIN-m5f胰岛素瘤细胞ERS，并抑制JNK的磷酸化，最终阻止细胞发生凋亡。本实验结果间接说明了GBP治疗2型糖尿病的可能机制之一，即GBP可能通过刺激胃肠道分泌GLP-1来抑制胰岛细胞的ERS，并进一步通过调控JNK信号通路来抑制胰岛β细胞凋亡，从而改善胰岛β细胞功能，增加胰岛素分泌，最后控制血糖。

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