miR-22靶向SIRT1促进人脂肪肝细胞中脂肪沉积的机制研究

郑晓筠， 黄浩辉， 何 杰， 李瑜元， 聂玉强， 杜艳蕾， 周永健

广州医科大学附属广州市第一人民医院 广州消化疾病中心，广东 广州 510180

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)已成为我国仅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病，呈持续升高态势[1]。二次打击学说是NAFLD发病机制的主要学说，强调脂质代谢紊乱所导致的肝细胞脂质沉积是其发病的关键环节[2]。近几年多次打击学说认为，基因多态性及基因受体等在NAFLD发生、发展中有重要作用，NAFLD认为是一种遗传代谢应激相关性疾病[3]。miRNA是一类内生的、长度为20～24个核苷酸的小RNA，miRNA是基因表达重要的转录后调控因子，其调节涉及肝脏中的脂质体内平衡、炎症等多种生物学过程[4]。最近研究[5]发现，miR-22与糖尿病、心血管疾病发病机制相关，但与脂肪肝等代谢性疾病关系的研究较为欠缺。沉默信息调节因子(sirtuin type 1, SIRT1)是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，参与糖代谢、胰岛素分泌等多条代谢通路，对代谢综合征等发挥重要的作用，被证明与NAFLD的发生、发展相关[6]。因此，本文通过研究miR-22在L02人细胞脂肪肝模型中的变化，探讨其对NAFLD的作用及机制。

1 材料与方法

1.1细胞株正常肝细胞株L02购自北京北纳创联生物技术研究院，于质量浓度为100 g/L的胎牛血清的DMEM培养基、37 ℃和体积分数为5%的CO2条件下进行培养。

1.2试剂油酸(Oleic acid)、棕榈酸(Palmitic acid minimum 99%)、二甲基亚砜(DMSO)、油红O(Oil Red O)均购自Sigma公司；三酰甘油、谷丙转氨酶、谷草转氨酶试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Lipofectamine®2000购自上海英潍捷基贸易有限公司；Trizol提取RNA试剂盒购自Takara公司；染料法Hairpinit miRNAs定量和U6校准qRT-PCR试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司；miR-22 mimic和miR-22 inhibitor由广州市锐博生物科技有限公司合成；SIRT1人抗鼠抗体、羊抗鼠抗体购自美国Abcam公司。

1.3主要设备和材料倒置显微镜(OLYMPUS)，NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo)，荧光定量PCR仪 qTower2.2(德国耶拿)、S1000 PCR仪(Bio-rad)、酶标仪(BIOTEK)等。

1.4构建肝细胞脂肪变性模型将L02细胞接种于6孔板中，当细胞汇合率为70%～80%，每孔更换质量浓度为0.5 mmol/L软脂酸和油酸混合液(2∶1)FFA和质量浓度为100 g/L的FBS的DMEM培养液，于细胞培养箱内培养48 h成为细胞脂肪肝模型。

1.5实验分组L02细胞株培养后分为mimic NC组、miR-22 mimic组、inhibitor NC组和miR-22 inhibitor组。取对数生长期细胞，以每孔70%密度在6孔板铺同等数量细胞；于无菌EP管内，将5 μl Lipofectamine®2000与245 μl opti-MEM培养物在25 ℃混匀5 min，另一无菌EP管，10 μl miR-22 mimic/miR-22 inhibitor或转染对照物与245 μl opti-MEM培养物稀释，将两者混合在25 ℃放置15 min，以每孔500 μl加入相应的6孔板中；6 h后弃液，更换质量浓度为0.5 mmol/L的FFA和质量浓度为100 g/L的FBS的DMEM培养液，继续培养48 h。每组设置2个副孔，实验重复3次。

1.6油红O染色及油红含量测定用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液固定细胞10 min，质量浓度为5 g/L的油红O避光染色60 min，洗涤干净后在显微镜下观察脂滴情况；使用异丙醇脱色，吸入96孔板，每孔100 μl，在酶标仪中读取510 nm处的吸光度。

1.7甘油三脂及肝酶含量测定经胰酶消化细胞，细胞裂解后收集上清液，参照试剂盒说明书步骤测定细胞内TG、GPT、GOT的含量。

1.8miR-22的表达水平检测参照TaKaRa试剂说明书，用Trizol试剂提取上述各组细胞的RNA；按照Hairpin-it miRNAs定量试剂盒上说明书的反应体系及反应条件，在PCR仪上进行逆转录，再在荧光定量PCR仪进行扩增。把U6作为内参照，以2-ΔΔCt表示待测组中miR-22相对于对照组中表达水平的表达倍数，其中ΔΔCt=待测组样本的ΔCt-对照组样本ΔCt，ΔCt=目的miR-22 Ct值-内参U6 Ct值。

1.9生物信息学分析通过TargetScan、MiRanda、Mirdb靶基因数据库作生物信息学分析，预测miR-22的靶基因，结合文献筛选出预计与NAFLD相关的基因。TargetScan网址http://www.targetscan.org/vert-71/；MiRanda网址http://www.microrna.org/；Mirdb网址http://www.mirdb.org/miRDB。

1.10Westernblotting检测SIRT1蛋白表达细胞裂解后，蛋白定量；调节电压为110 V，SDS-PAGE电泳约2 h；调节恒流为350 mA湿转膜约1 h；BSA封闭1 h；一抗SIRT1人抗鼠抗体4 ℃摇床过夜孵育；二抗山羊抗兔抗体，常温孵育1 h；曝光、显影后，软件分析光密度值，以目的基因/β-actin带的密度比值表示目的基因蛋白表达水平。

1.11统计学分析使用IBM SPSS Statistics 19.0统计软件，以均数±标准差表示，符合正态分布的两组等方差数据间，采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1构建L02人脂肪肝细胞模型经油红O染色后，正常组的肝细胞略呈纺锤形，细胞边缘清晰，核膜完整，细胞内未见红色脂滴；模型组的脂肪变肝细胞略变圆，可见散在红色脂滴位于细胞膜的侧边缘，或呈环状位于胞内(见图1A)。细胞油红O染色及脱色后，模型组油红脱色含量与正常组比较显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，说明模型组脂滴显著比正常组多(见图1B)。模型组中TG含量比正常组显著增加，AST/ALT显著增高，差异均有统计学意义(P<0.01)，符合脂肪肝肝功能表现；ALT、AST差异无统计学意义，提示该构建脂肪肝模型方法未对细胞造成明显损伤，表明模型组构建脂肪肝模型成功，脂肪变明显(见图1C～1E)。

注：a：正常组正常细胞；b：模型组脂肪变细胞。*P<0.05，#P>0.05。

2.2脂肪变细胞模型miR-22表达显著增加成功建立脂肪细胞肝模型后，提取正常组和模型组细胞RNA，使用PCR检测miR-22的表达量。正常组miR-22 mRNA相对表达量为1.551±0.1525，模型组miR-22 mRNA相对表达量为2.221±0.1834，模型组miR-22 mRNA的表达量与正常组比较显著增加，差异有统计学意义(P=0.0126)(见图2)。

注：*P<0.05。图2 L02人肝正常细胞和脂肪变细胞miR-22 mRNA表达量Fig 2 The expression of miR-22 mRNA in L02 normal hepaticcells and steatosis cells

2.3miR-22促进人脂肪肝细胞的脂肪沉积分别转染miR-22 mimic和miR-22 inhibitor，过表达miR-22和抑制miR-22后再建立脂肪变性细胞模型，油红O染色可见，与mimic NC组相比，miR-22 mimic组脂滴显著增加，脂滴变大，胞内较多深染的脂滴呈抱团状；与inhibitor NC组相比，miR-22 inhibitor组脂滴相对减少，脂滴染色变浅，胞内未见明显深染的抱团脂滴(见图3A)。细胞油红O染色脱色后，miR-22 mimic组油红脱色含量比mimic NC组显著增加，差异有统计学意义(P=0.0034)；miR-22 inhibitor组油红脱色含量与inhibitor NC组相比呈减少趋势(P=0.0847)，miR-22 mimic组与miR-22 inhibitor组相比显著增加，差异有统计学意义(P<0.0001)，说明过表达miR-22后诱导的脂肪肝细胞模型脂滴显著增加，抑制miR-22后诱导的脂肪肝细胞模型脂滴显著减少(见图3B)。miR-22 mimic组TG含量和AST/ALT与mimic NC组比较均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-22 inhibitor组中TG含量比inhibitor NC组显著减少，差异有统计学意义(P=0.0445)，AST/ALT值与inhibitor NC组相比呈减少趋势(P=0.8385)(见图3C～3E)。以上结果表明，过表达miR-22后诱导的人脂肪肝细胞脂肪沉积加重，抑制miR-22后诱导的人脂肪肝细胞脂肪沉积减轻。

注：*P<0.05,#P>0.05。

图3过表达miR-22和抑制miR-22及其对照组的肝脂肪变细胞模型相关检测结果A：油红O染色(200×)；B：油红O染色脱色油红含量测定；C：TG含量；D：AST/ALT比值；E：ALT和AST含量

Fig3RelevanttestresultsoftransfectedmiR-22mimicandmiR-22inhibitorintoL02humansteatotichepatocytesanditscontrolgroupA: oil red O staining (200×); B: determination of oil red decolorization by oil red O staining; C: the content of TG; D: the ratio of AST/ALT; E: the content of ALT and AST

2.4脂肪变细胞模型SIRT1蛋白表达显著减少成功建立脂肪细胞肝模型后，检测正常组和模型组的SIRT1蛋白表达，灰度值扫描后统计分析。模型组脂肪肝细胞SIRT1蛋白表达量与正常组比较显著减少，差异有统计学意义(P=0.0249,见图4)。

注：*P<0.05。

图4正常组和模型组的SIRT1蛋白表达A：SIRT1 Western blotting曝光图像；B：SIRT1蛋白表达灰度值分析

Fig4TheexpressionsofSIRT1proteininL02humansteatotichepatocytemodelandcontrolgroupA: SIRT1 Western blotting exposure images; B: the gray value analysis of SIRT1 protein expression

2.5miR-22负调控SIRT1促进脂肪肝细胞脂肪沉积使用TargetScan、MiRanda、Mirdb预测miR-22的靶基因发现，SIRT1是miR-22的靶基因(见图5)。分别转染miR-22 mimic和miR-22 inhibitor，过表达miR-22和抑制miR-22后再建立脂肪变性细胞模型，Western blotting检测SIRT1蛋白表达，灰度值扫描后统计分析，在正常细胞和脂肪变肝细胞中，miR-22 mimic组SIRT1蛋白表达量比mimic NC组显著降低，差异均有显著统计学意义(P<0.05)，结果显示，过表达miR-22后，SIRT1的表达量减少，提示miR-22负调控SIRT1。

在正常细胞中，miR-22 inhibitor组SIRT1蛋白表达量与inhibitor NC组相比呈增加趋势，差异无统计学意义(P=0.0801)；在脂肪肝细胞中，miR-22 inhibitor组SIRT1蛋白表达量与inhibitor NC组比较呈增加趋势，差异无统计学意义(P=0.0674)(见图6A～6B)，结果显示，抑制miR-22后，SIRT1的表达量呈增加趋势，与过表达miR-22时趋势相一致。

图5 TargetScan、Microrna、Mirdb网站预测SIRT1是miR-22的靶基因Fig 5 TargetScan, Microrna and Mirdb sites predicted that SIRT1 was the target gene of the miR-22

注：*P<0.05,#P>0.05。

图6过表达miR-22和抑制miR-22及其对照组的SIRT1蛋白表达A：SIRT1 Western blotting曝光图像；B：SIRT1蛋白表达的灰度值分析

Fig6TheexpressionofSIRT1proteinoftransfectedmiR-22mimicandmiR-22inhibitorintoL02humansteatotichepatocytesanditscontrolgroupA: SIRT1 Western blotting exposure images; B: the gray value analysis of SIRT1 protein expression

3 讨论

NAFLD发病机制尚未明确,近来不少研究[7]发现，miRNA与NAFLD进展有关，预计miRNA对NAFLD的筛查、疾病分期和监测疾病进展及疾病的治疗均有重要意义，但具体何种miRNA参与NAFLD的发生、发展机制及如何作用尚未完全了解。现有研究[8]提示，miR-22表达与肝脏肿瘤发生具有负相关性。SIRT1下调会使部分脂肪生成和糖异生相关基因的表达改变，如下调PPARα信号并降低脂肪酸β-氧化，且会诱导局部炎症、内质网应激及胰岛素抵抗，SIRT1通过参与脂质和碳水化合物代谢的调节在NAFLD的发展中起关键作用[9]。本研究通过体外实验，初步探讨肝细胞脂肪变时miR-22的表达变化及其促进脂肪沉积的机制，SIRT1是miR-22预测的靶基因，研究结果显示，miR-22在肝细胞脂肪变时表达显著增加，miR-22可能通过表达上调负调控SIRT1表达从而促进脂肪沉积。

本实验使用正常人肝细胞株L02脂肪变性细胞模型能较好地模拟NAFLD病变过程中的肝细胞脂质沉积，较广泛地应用在研究当中[10]。油红O染色及油红脱色含量测定能较好地检测细胞内脂滴变化情况，同时TG含量和AST/ALT能较好地反映脂肪肝变性的严重程度[11]。为进一步验证miR-22对肝细胞脂肪变的作用，过表达miR-22和抑制miR-22后建立脂肪变性细胞模型，结果提示，过表达miR-22检测结果均提示脂肪变程度显著加重，抑制miR-22后部分检测结果差异无统计学意义，考虑miR-22在细胞中原表达量较低，抑制后对脂肪沉积的作用较轻微，但总体趋势一致，说明miR-22参与脂肪肝的脂肪沉积。SIRT1在脂肪肝中表达变少，其结果与其他文献[12]报道一致，过表达miR-22后，SIRT1蛋白表达显著减少，靶基因预测结果考虑miR-22负调控SIRT1表达从而促进脂肪沉积，miR-22可能成为脂肪肝新的检测方向和治疗靶标。

本研究探讨并验证了miR-22在脂肪沉积过程中的作用，并初步探讨了miR-22表达上调负调控SIRT1促进脂肪沉积的机制。我们前期实验[13]已经在体内验证了FXR基因与NAFLD密切相关，同时有实验[8]表明，miR-22与FXR密切相关，但缺乏直接验证靶基因的实验，因此，进一步验证miR-22的靶基因，深入探讨miR-22上下游基因及与FXR相关通路促进NAFLD的机制。此外，细胞模型存在局限性，将在人体NAFLD组织或动物模型上进一步确定miR-22对NAFLD的作用。

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